原文：Multi-layered target identification strategy of natural products: Daphnetin targets NQO1 and OPLAH in silicosis alleviation.
期刊：Journal of pharmaceutical analysis（影响因子 5.0） |
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矽肺（silicosis）是最常见、最具代表性的尘肺病类型，由长期吸入游离二氧化硅粉尘引起，以不可逆、进行性肺纤维化为特征。患者常出现胸闷、劳力性呼吸困难和慢性咳嗽，生活质量严重受损。全球范围内，尘肺病仍是重大公共卫生问题，而目前尚无特效靶向药物获批用于矽肺治疗。在中国，仅有汉防己甲素（tetrandrine）获批用于矽肺；用于特发性肺纤维化的抗纤维化药物如尼达尼布和吡非尼酮也被尝试用于矽肺管理，但疗效与机制仍有限。
天然产物一直是创新药物发现的重要来源。近年来，姜黄素、丹参酮IIA以及瑞香素（daphnetin）等天然产物在矽肺动物模型中显示出抗纤维化潜力。然而，这些化合物究竟作用于哪些“功效靶点”——包括直接结合的直接靶点，以及受直接靶点调控、进而影响信号通路与代谢网络的间接靶点——仍缺乏系统解析。这限制了其机制阐明与临床转化。
核心发现：瑞香素如何缓解矽肺纤维化
本研究以瑞香素为案例，系统验证了其在体外和体内的抗矽肺效应，并鉴定出其功效靶点。研究团队通过大鼠矽肺模型发现，气管内注入二氧化硅后，模型大鼠出现呼吸频率改变与运动能力下降；而口服瑞香素（15、30、60 mg/kg）或阳性对照汉防己甲素（30 mg/kg）连续28天，可减轻二氧化硅诱导的肺组织病理损伤。
Fig. 1 瑞香素减轻二氧化硅诱导的大鼠肺组织病理学损伤。(A) 动物实验方案示意图。(B) 呼吸频率测量（n = 9）。(C) 转棒实验（n = 9）。(D) 肺部代表性大体图像（n = 3）。(E) 肺指数（n = 9）。(F) 血清转化生长因子-β1（TGF-β1）水平（n = 6）。(G) 苏木精-伊红（H&E）染色（左）及相应炎症评分（右）（n = 4）。(H) 天狼星红染色（左）及胶原面积半定量分析（右）（n = 4）。(I) Masson三色染色及结节面积定量分析（n = 4）。(J–M) 免疫组织化学染色（左）及纤维化相关蛋白半定量分析（右）（n = 4）：纤连蛋白（FN）(J)、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）(K)、I型胶原（COL-1）(L) 和波形蛋白（VIM）(M)。∗P < 0.05，∗∗P < 0.01，∗∗∗P < 0.001 与对照组相比；#P < 0.05，##P < 0.01，###P < 0.001 与矽肺组相比。
组织学分析显示，瑞香素降低了矽肺相关的纤维化标志物，包括纤连蛋白（FN）、I型胶原（COL-1）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和波形蛋白（VIM）的表达，改善肺组织结构。在细胞层面，瑞香素影响巨噬细胞极化、上皮-间质转化（EMT）和成纤维细胞活化：在二氧化硅刺激的THP-1细胞中调节精氨酸酶1（ARG1）表达，在A549、BEAS-2B、NIH 3T3及THP-1细胞中干预EMT与纤维化相关表型。
Fig. 2 瑞香素对巨噬细胞极化、上皮-间质转化（EMT）及成纤维细胞活化的影响（n = 3）。(A) 暴露于二氧化硅（100 μg/mL）的THP-1细胞中精氨酸酶1（ARG1）的表达。(B) 暴露于二氧化硅（150 μg/mL）的A549细胞中纤连蛋白（FN）和E-钙黏蛋白（E-cad）的表达。(C) 暴露于二氧化硅（200 μg/mL）的NIH 3T3细胞中FN和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达。(D, E) 经转化生长因子β1（TGF-β1）（10 ng/mL）处理的A549（D）和NIH 3T3（E）细胞中FN和α-SMA的表达。(F, G) 经TGF-β1处理的A549（F）和NIH 3T3（G）细胞的划痕愈合实验。∗P < 0.05，∗∗P < 0.01，∗∗∗P < 0.001 与对照组相比；#P < 0.05，##P < 0.01，###P < 0.001 与SiO2组相比。GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶。
更重要的是，研究通过多层策略锁定了瑞香素的直接作用靶点：NAD(P)H醌氧化还原酶1（NQO1）和5-氧脯氨酸酶（OPLAH）被确认为瑞香素的直接靶点；而Kelch样ECH关联蛋白1（KEAP1）、核因子红细胞2相关因子2（NRF2）和ARG1则被鉴定为间接靶点。值得注意的是，OPLAH是本研究首次报道的瑞香素直接靶点。
进一步机制研究表明，瑞香素与NQO1和OPLAH的结合，有助于解释其对细胞硫醇水平的影响。利用硫醇响应探针，研究者观察到瑞香素显著提高了A549和THP-1细胞内的硫醇水平，并降低二氧化硅诱导的活性氧（ROS）积累，从而发挥抗氧化作用。过表达OPLAH可显著提升还原型谷胱甘肽（GSH）水平，并缓解二氧化硅诱导的EMT；相反，敲低OPLAH则部分抑制了瑞香素的疗效。这些结果共同阐明了瑞香素的抗纤维化机制。
方法亮点：多层靶点识别策略
本研究提出并实施了一套“多层靶点识别策略”，整合了转录组学、临床代谢组学、公共数据库挖掘、基于人工智能（AI）的靶点预测模型，以及基于组织的热蛋白质组分析（Tissue-TPP）技术。该策略实现了从“尘肺相关靶点”到“瑞香素功效靶点”，再到“直接靶点”的逐步解析。
Fig. 3 天然产物（NPs）靶标识别的多层策略。(A) 尘肺基因表达特征的构建。(B) 利用基因表达特征识别瑞香素的候选疗效靶标。(C) 尘肺代谢物-酶关联网络的构建。(D) 瑞香素代谢组学来源的疗效靶标识别。(E) 瑞香素疗效靶标的整合。(F) 利用基于组织的热蛋白质组分析（Tissue-TPP）识别直接靶标。(G) 直接靶标的验证与机制表征。FC：倍数变化；CTD：比较毒理基因组学数据库；GEO：基因表达综合数据库；ITCM：中药成分；DMSO：二甲基亚砜；CETSA：细胞热位移分析；MD：分子动力学。
首先，研究者从GEO数据库获取尘肺相关转录组数据，使用biomaRt标准化基因符号，并用Limma筛选差异表达基因（DEGs，标准为P<0.05且|log2FC|≥1）。同时从CTD和GeneCards以“pneumoconiosis”或“pulmonary fibrosis”为关键词收集中位推断或相关性评分以上的疾病基因，取交集构建尘肺基因表达特征。
Fig. 4 通过转录组数据分析识别瑞香素的疗效靶标。(A) 构建尘肺基因表达特征的工作流程。(B) 不同来源尘肺相关基因的维恩图。(C) 构建瑞香素相关基因表达特征的工作流程。(D) 瑞香素相关靶标与尘肺相关靶标之间的维恩分析。(E) 57个候选靶标与基因特征功能表征（FRoGS）预测靶标之间的维恩分析。(F) 29个重叠疗效靶标的网络图。(G) 29个疗效靶标的Reactome通路富集分析。BALF：支气管肺泡灌洗液；FC：倍数变化；CTD：比较毒理基因组学数据库；GEO：基因表达综合数据库；NFE2L2：核因子红细胞2相关因子2；KEAP1：Kelch样ECH关联蛋白1。
其次，利用CMap平台获取瑞香素（10 μM）在A375、A549、HA1E、HCC515、HT29、MCF7、PC3、VCAP等细胞系中的基因表达谱（|Z-score|≥2），并结合GEO中瑞香素处理A2780和SKOV3细胞24小时的RNA-seq数据（GSE267812），以P<0.05且|log2FC|≥2筛选，定义出现频率≥3的基因为瑞香素表达特征。
在AI预测方面，研究采用已发表的FRoGS深度学习模型（GitHub获取代码与预训练基因嵌入向量），以化合物标识符BRD-K61269089为输入，在cDNA和shRNA模型中预测瑞香素靶点，筛选得分≥0.95者作为候选。
临床代谢组学方面，研究者检索PubMed与ScienceDirect中“pneumoconiosis”和“metabolomics”相关研究，人工整理差异代谢物，通过KEGGREST获取KEGG ID，并用Cytoscape的Metscape插件构建代谢物-酶网络，识别相关代谢酶。动物肺组织则采用伪靶向代谢组学与氨基酸代谢组学（UHPLC-MS/MS，MRM模式）分析，筛选矽肺差异代谢物及瑞香素调控的代谢物。
Fig. 5 瑞香素疗效靶标的构建、分析与验证（n = 6）。(A) 构建尘肺相关代谢物-酶网络的工作流程。(B) 显示瑞香素调控酶与尘肺相关酶之间重叠的维恩图。(C) 瑞香素114个代谢相关疗效靶标的网络。(D) 114个疗效靶标的京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析。(E, F) 分别基于GSE264182和GSE165489数据集的矽肺患者中5-氧脯氨酸酶（OPLAH）(E) 和精氨酸酶1（ARG1）(F) 的信使RNA（mRNA）水平。(G–K) 大鼠肺组织中Kelch样ECH关联蛋白1（KEAP1）(G)、ARG1 (H)、核因子红细胞2相关因子2（NRF2）(I)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氢（NAD(P)H）醌氧化还原酶1（NQO1）(J) 和OPLAH (K) 的蛋白质印迹及半定量分析。∗P < 0.05，∗∗P < 0.05，∗∗∗P < 0.001 与对照组相比；#P < 0.05，##P < 0.01，###P < 0.001 与矽肺组相比。GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶。
最关键的一步是直接靶点筛选：研究使用Tissue-TPP技术。大鼠口服瑞香素（20 mg/kg）2小时后取肺组织，或肺组织裂解液体外与100 μM瑞香素孵育，再进行37.0–67.0°C梯度加热、离心去聚集蛋白，SDS-PAGE与LC-MS/MS鉴定热稳定性改变的蛋白（鉴定得分>100且分子量匹配）。Western blot验证并计算熔解温度（Tm）与热位移（ΔTm），从而确认NQO1和OPLAH为直接结合靶点。
Fig. 6 瑞香素直接结合靶标的筛选与验证。(A) 使用基于组织的热蛋白质组分析（Tissue-TPP）进行直接靶标筛选的工作流程示意图。(B) 口服或体外瑞香素处理后，57.2 °C下肺组织匀浆的热稳定性曲线。(C, D) 体内细胞热位移分析（CETSA）验证直接结合，显示口服瑞香素后烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氢（NAD(P)H）醌氧化还原酶1（NQO1）(C) 和5-氧脯氨酸酶（OPLAH）(D) 的免疫印迹和定量熔解曲线。(E) 肺组织中核因子红细胞2相关因子2（NRF2）和精氨酸酶1（ARG1）的CETSA分析显示瑞香素处理后无热位移。(F, G) 评估用于对接的NQO1 (F) 和OPLAH (G) 模型结构质量的拉氏图。(H, I) 分子对接预测的瑞香素与NQO1 (H) 和OPLAH (I) 的结合模式。PBS：磷酸盐缓冲液；DMSO：二甲基亚砜。
随后，研究通过分子对接（AutoDock Vina）、分子动力学模拟（GROMACS 2022.2）以及虚拟丙氨酸扫描，分析瑞香素与NQO1（PDB: 8RFN）和OPLAH（AlphaFold DB: O14841）的结合模式与关键残基。细胞实验中构建OPLAH过表达与敲低质粒转染A549细胞，验证其功能。
Fig. 7 瑞香素直接调控烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氢（NAD(P)H）醌氧化还原酶1（NQO1）的表达且不依赖于核因子红细胞2相关因子2（NRF2）（n = 3）。(A–D) 瑞香素对暴露于二氧化硅的A549 (A)、BEAS-2B (B)、NIH 3T3 (C) 和THP-1 (D) 细胞中NRF2和NQO1表达水平的影响。(E, F) ML385对A549细胞中NRF2和NQO1蛋白（E）和信使RNA（mRNA）（F）水平的影响。(G, H) ML385联合瑞香素对暴露于二氧化硅（150 μg/mL）的A549细胞中NRF2和NQO1蛋白（G）和mRNA（H）水平的影响。∗P < 0.05，∗∗P < 0.01，∗∗∗P < 0.001 与对照组相比；#P < 0.05 和 ###P < 0.001 与模型组相比。
Fig. 8 5-氧脯氨酸酶（OPLAH）介导的瑞香素抗纤维化作用（n = 3）。(A–D) 瑞香素对暴露于二氧化硅的A549 (A)、BEAS-2B (B)、NIH 3T3 (C) 和THP-1 (D) 细胞中OPLAH表达水平的影响。(E) 转染OPLAH过表达（OE）质粒48 h后A549细胞中OPLAH和纤连蛋白（FN）的表达水平。(F) OPLAH OE对暴露于二氧化硅的A549细胞中FN和E-钙黏蛋白（E-cad）表达的影响。(G) 转染OPLAH敲低质粒48 h后A549细胞中OPLAH和FN的表达水平。(H) 瑞香素对暴露于二氧化硅（150 μg/mL）的OPLAH敲低A549细胞中FN表达的影响。∗P < 0.05，∗∗P < 0.01，∗∗∗P < 0.001 与对照组相比；#P < 0.05，##P < 0.01，###P < 0.001 与模型组相比。GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶；sh-NC：短发夹RNA（shRNA）阴性对照。
Fig. 9 瑞香素通过维持细胞内硫醇水平减轻二氧化硅诱导的氧化应激（n = 3）。(A, B) 在存在或不存在瑞香素条件下，二氧化硅处理24 h后THP-1（A）和A549（B）细胞中活性氧（ROS）的代表性荧光图像及定量。(C, D) 相同处理条件下THP-1（C）和A549（D）细胞中细胞内硫醇水平的代表性荧光图像及定量。(E, F) 在存在或不存在瑞香素条件下，二氧化硅处理后THP-1（E）和A549（F）细胞中的谷胱甘肽（GSH）水平。(G) 二氧化硅（150 μg/mL）处理后，OPLAH过表达（OE）的A549细胞中的GSH水平。(H) 在存在或不存在瑞香素条件下，二氧化硅（150 μg/mL）处理后OPLAH敲低的A549细胞中的GSH水平。∗P < 0.05，∗∗P < 0.01，∗∗∗P < 0.001 与对照组相比；#P < 0.05，##P < 0.01，###P < 0.001 与模型组相比。DCFH-DA：2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯；NC：阴性对照；sh-NC：短发夹RNA（shRNA）NC。
应用意义：为天然产物靶点发现提供框架
该研究不仅澄清了瑞香素抗矽肺的分子机制，支持其作为矽肺治疗候选药物的潜力，更重要的是提供了一套实用的天然产物靶点发现框架。传统天然产物研究常止步于“有效但不知靶点”，而本策略将公共数据库、AI预测、临床与动物代谢组、以及Tissue-TPP实验验证串联起来，可区分直接靶点与间接靶点。
对科研而言，这一多层策略可推广至其他天然产物及中药活性成分的机制研究；对临床转化而言，明确NQO1、OPLAH及KEAP1/NRF2/ARG1轴的作用，为开发针对氧化应激与谷胱甘肽代谢通路的抗纤维化干预提供了新方向。正如论文所示，瑞香素通过维持细胞内硫醇与GSH水平、抑制ROS与EMT，在矽肺缓解中发挥作用，而OPLAH作为新靶点的发现尤为关键。
论文发表于《Journal of Pharmaceutical Analysis》（影响因子5.0），题为“Multi-layered target identification strategy of natural products: Daphnetin targets NQO1 and OPLAH in silicosis alleviation”。该工作为尘肺病这一尚无特效药的 occupational lung disease 带来了基于天然产物的机制性突破。
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