原文：Genomic and Transcriptomic Landscapes of MEN1-Wild-Type Low-Grade Metastatic Pancreatic NETs Uncover Key Oncogenic Drivers and Targetable Pathways. PubMed | PMC 全文（含 PDF）
研究背景：被忽视的一大类胰腺神经内分泌肿瘤
胰腺神经内分泌肿瘤（pNETs）来源于胰腺中产生激素的神经内分泌细胞，是一组高度异质性的肿瘤。根据美国癌症协会的估计，仅在美国，2020年就有超过4000人被诊断为pNETs。与其他一些癌症相比，pNETs患者总体生存期相对较长，因此带瘤生存的人群规模不断累积；但其临床表现差异极大——从惰性病变到即便组织学分级很低（WHO G1/G2）仍会发生淋巴结或肝转移的侵袭性肿瘤都有，管理起来非常棘手。
过去十余年的大规模基因组研究已经为pNETs建立了“经典框架”：MEN1、DAXX、ATRX 等基因的失活，以及PI3K–Akt–mTOR 通路（如PTEN缺失）的异常激活，是主要驱动事件。基于这些发现，依维莫司（everolimus）、舒尼替尼（sunitinib）等药物已进入临床，能延长晚期患者无进展生存期。然而，持久控制和可靠生物标志物仍然有限。
更重要的是，既往机制认识大多来自“MEN1突变富集”的队列。而在散发性pNETs中，MEN1野生型（MEN1-wild-type） 疾病构成了一个庞大却长期被忽视的亚群：它们没有典型的MEN1突变，却依然可能转移。低到中等的肿瘤突变负荷（TMB）并不能可靠地区分预后，这提示——转移能力可能并不来自“突变数量”的多少，而是来自若干共同致癌通路被“定量强化”后的网络状态。
为了填补这一空白，研究团队排除了高级别和MEN1突变的pNETs，专门组建并分析了一组严格定义的MEN1野生型、WHO G1/G2级（即低级别）pNETs 队列，其中约25%伴有淋巴结和/或肝转移，并对同一批肿瘤进行全外显子测序（WES）与RNA测序（RNA-seq）的匹配整合。
Figure 1 FFPE组织的患者纳入与亚分类概览。A. pNET患者FFPE纳入与排除的流程图。从低级别pNET患者队列中，选取了来自104例不同患者的FFPE活检组织。全部样本池接受了全外显子测序（WES）和RNA测序（RNA-seq）。导致样本排除的筛选标准以浅绿色突出显示。最终选定的样本集以白框表示。转移性样本以浅粉色突出显示。B. pNET患者亚分类及样本处理示意图。75例原发性pNET根据其转移结局分为两大类。C. pNET队列按性别分层的年龄分布。变量的分布及中位数通过箱线图上聚集的数据点进行可视化。D. 1级和2级pNET患者中淋巴血管侵犯（LVI）、神经周围侵犯（PNI）和转移（METs）的百分比。精确百分比显示于每根柱的顶部。N，阴性（蓝色）；P，阳性（红色）。来源说明：Figure 1B 使用 BioRender (https://biorender.com/) 制作。核心发现一：转移不是“突变更多”，而是“通路汇聚”
研究共从Emory大学组织库获取104例FFPE样本（98例低级别pNET及6例正常胰腺），最终对75例原发G1/G2 pNETs完成了WES与RNA-seq配对分析。患者平均年龄约55.83岁，性别作为生物变量被纳入考量；在转移组与非转移组之间，年龄和性别分布并无明显偏倚。
从全基因组改变图谱来看，整体突变负荷中等：每位患者中位突变数为1082（范围10–12800），外显子区TMB中位为8.43 mutations/Mb（范围0.07–109）。转移性肿瘤的外显子TMB略高（中位10.90 vs 非转移8.01），但碱基替换谱高度保守 ——均以C>T转换为主的嘧啶突变模式，六类SNV谱在转移与非转移肿瘤间没有发生定性改变。
Figure 2 pNET中检测到的大规模基因组改变概览，按转移潜能和分化级别排序。A. pNET基因组特征概览，肿瘤突变负荷（TMB）按转移潜能和分化级别排序。对于每个pNET（n = 75），显示了每兆碱基（Mb）的基因组突变数。B. 所有pNET样本中所有突变类型的突变百分比。C. 外显子TMB概览，按转移潜能和分化级别排序。对于每个pNET（n = 75），显示了外显子Mb数。D. 所有pNET样本中所有突变类型的外显子突变百分比。E. 嘧啶点突变作为总单核苷酸变异（SNVs）的相对频率（百分比），所有pNET样本分为六类。F. 基于患者转移状态的原发性肿瘤分类。转移性患者样本以红色表示，非转移性患者样本以蓝色表示。G. 基于部位的转移分类。肝转移以绿色表示，淋巴结转移以橙色表示，多部位转移以浅紫色表示，非转移性样本以蓝色标记。H. pNET的分化级别；1级（G1）样本以红色显示，2级（G2）样本以蓝色显示。I. 来自病理记录的增殖指数（Ki-67），评分范围0-16以深紫色（最低分）到黄色（最高分）之间的渐变表示。在基因层面，所有肿瘤都至少携带一组高频突变基因中的编码改变。非转移与转移肿瘤共享一个“突变骨架”：黏蛋白/结构基因（如MUC17、MUC16、TTN、AHNAK ）以及大量锌指转录因子（如ZNF729、ZNF208、ZNF9、ZNF43 ）频繁突变。转移肿瘤并非出现了全新的突变过程，而是在少数基因上出现频率偏移。
Figure 3 pNET研究队列中的体细胞改变和肿瘤突变负荷概览。A. 显示来自非转移状态患者的56例原发性pNET中前五十个 recurrently mutated genes 和七个经典基因的热图（Oncoprint）。B. 显示来自转移状态患者的19例原发性pNET中前五十个 recurrently mutated genes 和七个经典基因的热图（Oncoprint）。每列代表一个个体肿瘤，每行代表一个基因，按突变频率降序排列。热图上方的堆叠条形图描绘了每个样本的肿瘤突变负荷（TMB；每兆碱基突变数）。条形的高度反映总TMB，颜色表示不同突变类别的贡献。右侧的水平条形图显示每个基因中至少携带一个突变的肿瘤数量。下方“经典（Canonical）”面板中的基因突出了本队列中分析的既定癌症驱动基因。热图中的彩色框表示该基因-肿瘤对中观察到的突变类型。C. 气泡散点图，对比转移性与非转移性pNET中 recurrent gene mutations 的患病率。突变频率表示为携带≥1个编码改变的病例百分比。每个气泡代表共享相同频率对的一个或多个基因，气泡大小编码该坐标处的基因数量（图例，右侧）。红色虚线对角线标记组间相等。D. 高突变pNET中的经典致癌通路改变和功能富集。与正常胰腺组织相比，pNET中突变景观改变所影响的通路。条形图总结了主要致癌信号通路中体细胞改变的分布。通路按改变基因数量降序排列。对于每个通路，右侧面板显示了所有pNET样本中改变的相对比例。E. 经典信号通路（包括RTK-RAS、NOTCH、WNT和Hippo信号）的基因水平突变图谱。列代表个体肿瘤，行代表每个通路内的个体基因。红色方块表示相应肿瘤中该基因存在至少一个体细胞突变。红色基因名称标记核心经典驱动因子，而蓝色突出显示必需信号或其他潜在可成药组分。F. 维恩图，描绘非转移性与转移性患者pNET样本之间重叠的突变基因数量。百分比代表合并基因集的比例。G. 与非转移性样本相比，转移性患者pNET样本中前二十个KEGG通路的功能富集。H. 与非转移性样本相比，转移性患者pNET样本中前二十个标志性基因集的功能富集。每个点对应一个显著富集的通路或基因本体术语。x轴表示富集显著性，色标表示校正后p值（log10转换），点大小反映输入列表中贡献于每个术语的基因数量。当把突变映射到通路水平时，真正关键的图景出现了：RTK–RAS、WNT/β-catenin、NOTCH、Hippo、细胞周期、TGF-β、PI3K/mTOR、Myc、p53等经典致癌通路被共同扰动。不同肿瘤里突变的基因组合高度异质，但都汇聚到同一条信号轴 上——这正支持了研究者的核心假设：低级别pNET的转移能力来自“通路状态的强化”，而非单纯突变数量增加。
核心发现二：转录组揭示钙、WNT与PI3K–AKT程序在转移中激活
团队进一步比较了肿瘤与正常胰腺、以及非转移与转移肿瘤之间的转录组。与正常胰腺相比，pNETs发生显著转录重编程：下调最明显的是免疫与信号调节因子（如MKNK1-AS1、SOS2、CXCL10），而上调基因包括参与突触信号、黏附和受体调控的SNTG1、RIMS2、GPC6等。
Figure 4 低级别pNET患者样本中的差异基因表达。A. 与正常胰腺相比，pNET患者样本中差异表达基因的火山图。x轴显示log2倍数变化，y轴显示-log₁₀校正P值。红点和蓝点分别表示显著上调和显著下调的基因。标记了上调和下调最显著的基因。B. 差异表达基因（DEGs）的无监督层次聚类热图。每列代表一个个体肿瘤，每行代表一个基因。相对表达以色标描绘，其中红色表示较高表达，蓝色表示较低表达。热图下方的注释条指示每个样本的临床/病理特征：组别、转移状态、WHO级别（G1和G2）和肿瘤大小（≤2 cm vs >2 cm）。C. 显示非转移性与转移性肿瘤之间DEG功能富集分析的水平条形图。顶级KEGG和基因本体（GO；生物过程、细胞组分和分子功能）富集按显著性排序。D. 与非转移性样本相比，转移性患者pNET样本中前二十个KEGG通路的DEG相关功能富集。E. 与非转移性样本相比，转移性患者pNET样本中前二十个标志性基因集的DEG相关功能富集。每个点对应一个显著富集的通路或GO术语。x轴表示富集显著性，色标表示校正后p值（log10转换），点大小反映输入列表中贡献于每个术语的基因数量。在非转移 vs 转移的差异表达分析中，转移性肿瘤富集于细胞周期、DNA复制修复、细胞外基质重组、细胞–细胞/细胞–基质互作以及细胞因子/免疫信号相关程序。KEGG与hallmark基因集的GSEA进一步确认：转移肿瘤在增殖、应激适应和肿瘤微环境交流方面具有 distinct 表达状态。
最关键的一步，是把体细胞突变基因 与差异表达基因 取交集。结果显示，仅有0.6%的基因同时发生突变和表达改变（置换检验p=0.0099），形成一个聚焦的29基因重叠集 。这29个基因虽然数量少，却精准标记了汇聚轴心，其中包括：RYR1 （细胞内钙释放通道，ryanodine receptor 1）和ZNF273 （锌指蛋白273，尤其突变富集于KRAB_A-box结构域，转移组中体细胞突变率达52.6%），以及CLCA1、CEACAM5、MYO3B等。
Figure 5 来自同一肿瘤的突变改变与转录变化的整合突出了低级别pNET中的关键基因和通路。A. 维恩图显示低级别pNET中显著突变基因与差异表达基因（DEGs）之间的重叠。每个区段中标明了基因数量。下图显示了重叠基因在非转移性和转移性pNET样本中的突变频率。B-C. 与重叠基因相关的关键通路。上图指示非转移性（右）和转移性（左）pNET样本中的基因突变频率。下方热图指示非转移性（粉色）和转移性（蓝色）pNET样本中DEG的计数。列代表样本，行代表基因。B. 转移性和非转移性pNET中钙信号通路基因的突变频率和差异表达。C. 转移性和非转移性pNET中WNT信号通路基因的突变频率和差异表达。D. ZNF273 (NM_021148) 体细胞突变在非转移性原发性pNET（n = 56）和转移性原发性pNET（n = 19）中的棒棒糖图（Lollipop plot）。线性示意图描绘了具有N端KRAB_A-Box结构域和C端锌指区域（zf-H2C2_2）的ZNF273蛋白。每个棒棒糖代表通过全外显子测序鉴定的一个体细胞变异，绘制在其密码子位置。E. 在具有转移状态的低级别pNET中观察到的临床可操作遗传改变。iPathwayGuide分析（Advaita Corp. 2025）比较了转移性pNET与非转移性pNET的基因表达，预测了在已发生转移的低级别pNET患者中可能具有可操作改变的药物。上游药物的预测基于实验中差异表达基因（DEGs）的富集以及来自Advaita知识库（AKB v18.1）的相互作用网络。条形图指示一致DEG的数量（左图）。iPathwayGuide分析比较了转移性pNET与非转移性pNET的基因表达，预测了在已发生转移的低级别pNET患者中可能不具有可操作改变的药物。条形图指示一致DEG的数量（右图）。F. Gene2Drug软件针对研究中观察到的（在整合遗传改变和基因表达数据后）转移性pNET中具有高肿瘤突变负荷的最高度重叠基因预测了多种药物。DOWN表示抑制作用。针对ZNF273改变的Gene2Drug预测药物（左图）。针对RYR1改变的Gene2Drug预测药物（右图）。BP，生物通路；CC，细胞组分；CGP，癌症相关药物扰动数据；DB，数据库；ES，富集分数；MF，分子功能；TFT，转录因子靶标集。通路映射表明，这29个基因集中在Calcium（钙信号）、WNT、以及KRAS/PI3K–AKT相关程序 上。GSEA证实：钙信号、WNT信号和PI3K–AKT信号在转移性pNETs中整体正向富集。也就是说，即便没有经典KRAS突变，KRAS下游效应网络也通过其他基因改变被调制；而钙信号与WNT则成为区分“会不会转移”的核心分子回路。
方法亮点：从多组学整合到可测试的治疗清单
本研究的创新不仅在于队列设计——专门锁定MEN1野生型低级别pNETs，更在于基因组+转录组匹配整合 的分析策略。研究者使用GATK识别WES变异，StringTie基于FPKM量化RNA表达，edgeR筛选差异表达基因（|log2FC|>1且FDR<0.05）。
在治疗预测方面，团队用iPathwayGuide 做上游调控因子推断，并用Gene2Drug 做基因中心药物扰动映射，对同一批肿瘤提名候选靶向或可重定位药物，预测哪些能逆转转移表达表型、哪些不太可能获益，从而给出优先、可测试的短名单——其中包括fasudil（法舒地尔）和spaglumic acid 等。
功能验证部分，研究者在pNET细胞系BON1和QGP1 （以及NECT2）中进行siRNA沉默实验：敲低ZNF273和RYR1后，细胞活力、克隆形成、3D球体生长和迁移能力均下降，说明它们是转移适应性的候选效应因子。免疫组化也在患者样本中验证了ZNF273和RYR1蛋白表达。
Figure 6 ZNF273和RYR1在pNET细胞系中的表达验证及其与生长、克隆形成、球体活力、迁移的关联，以及使用预测药物展示的可操作脆弱性。A. RT-qPCR显示BON1和QGP1细胞中ZNF273和RYR1相对于人胰岛（ABC-TC4286）对照的基线表达。B. RT-qPCR验证BON1和QGP1细胞中siRNA介导的ZNF273或RYR1敲低。C. 转染对照或靶向siRNA（ZNF273或RYR1）72小时后通过MTT法测量的细胞活力，显示为相对于指定对照的存活百分比（BON1细胞中RYR1沉默进行了5天）。D. 代表性结晶紫克隆形成测定及ZNF273或RYR1沉默7-10天后（与未转染和对照siRNA处理相比）的集落数量定量。E. 代表性3D球体及使用CellTiter-Glo测定（Promega Co.；AU，任意单位）对ZNF273或RYR1敲低后（BON1和QGP1，条件如图标注）球体生长/活力进行的基于发光的定量。F. 代表性Boyden小室迁移图像及siRNA转染（对照siRNA vs ZNF273或RYR1 siRNA）48小时后BON1和QGP1中迁移细胞的定量。G. BON1和QGP1用预测药物（包括harmol、buspirone、doxorubicin、fasudil和spaglumic acid）在微摩尔浓度范围内处理的剂量反应活力曲线（存活百分比 vs 药物剂量对数，如图所示）。H. QGP1球体用载体（DMSO，0.1%）或doxorubicin（1 µM）处理72小时的代表性图像（10x）及使用CellTiter-Glo测定（Promega Co.；AU，任意单位）进行的基于发光的定量。每个实验至少重复三次。数据以平均值±标准差表示，如图所示。统计学显著性使用非配对双尾Student t检验评估。统计学显著性在图中用星号表示（*, P <0.05; **, P <0.01; ***, P <0.001 和 ****, P <0.0001）。在药物层面，预测化合物在体外显示活性，其中多柔比星（doxorubicin） 表现出最强细胞毒效应；而fasudil和harmol在BON1与QGP1异种移植模型中接受了体内评估（遵循Wayne State University IACUC协议）。这些结果支持了一条“KRAB-ZNF/钙信号轴”作为转移性pNET的可操作治疗靶点。
Figure 7 ZNF273和RYR1在pNET患者中的免疫组化表达、功能验证及预测药物的体内评价。A. 小提琴图显示非转移性与转移性疾病患者以及伴有肝转移亚组的人pNET中ZNF273和RYR1的免疫组化H评分。ZNF273 H评分在非转移性与转移性肿瘤之间进行比较（n = 23和22，分别包括部分肿瘤的重复样本；P = 0.09）以及在非转移性肿瘤与伴有肝转移的肿瘤之间进行比较（n = 23和9，包括部分肿瘤的重复样本；P = 0.03）。RYR1 H评分在非转移性与转移性肿瘤之间进行比较（n = 27和22，包括部分肿瘤的重复样本；P = 0.10）以及在非转移性肿瘤与伴有肝转移的肿瘤之间进行比较（n = 27和10，包括部分肿瘤的重复样本；P = 0.05）。B. 非转移性和转移性pNET组织芯中ZNF273和RYR1的代表性免疫组化染色。C. BON1和QGP1细胞中RYR1沉默后ORAI1、STIM1和STIM2表达的RT-qPCR分析，以对照siRNA条件标准化。计算的STIM1:ORAI1表达比在BON1细胞中为0.64:1，在QGP1细胞中为1.05:1。D. 转染对照或RYR1 siRNA的QGP1细胞中的时间分辨Fluo-4荧光，证明RYR1沉默后细胞内Ca²⁺依赖性荧光降低。显示了测定阳性对照和测定阴性对照。E. BON1、QGP1和NECT2神经内分泌癌细胞中基础ZNF273蛋白表达的免疫印迹分析。下方免疫印迹证实了BON1和QGP1细胞中ZNF273-siRNA转染后ZNF273的耗竭。F. BON1和QGP1细胞中用doxorubicin (Dox) 或 fasudil (Fas) 处理后ZNF273表达的RT-qPCR分析、spaglumic acid (Spa) 处理后RYR1表达的RT-qPCR分析，以及用Dox、Fas、harmol (Har) 或 Spa 处理后β-catenin表达的RT-qPCR分析。表达值以相对于相应载体处理对照的形式呈现。G. ZNF273或RYR1沉默后单独或联合250或500 nM Dox的细胞存活率。未转染和对照siRNA细胞作为对照。在两种Dox浓度下，ZNF273沉默均显著降低了相对于对照siRNA细胞的存活率，而RYR1沉默后的相应差异不显著。H. 携带BON1细胞来源异种移植物并用载体、Fas或Har治疗的小鼠的肿瘤体积、终点肿瘤重量和体重。与载体治疗相比，Fas和Har降低了肿瘤重量（分别为P = 0.011和P = 0.005）。I. 携带QGP1细胞来源异种移植物并用载体、Fas或Har治疗的小鼠的肿瘤体积、终点肿瘤重量和体重。与载体治疗相比，Fas和Har降低了肿瘤重量（分别为P = 0.02和P = 0.03）。所有体外实验至少重复三次。条形图显示平均值，误差线代表SD。统计学显著性使用非配对双尾Student t检验评估。统计学显著性表示为 *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, 和 ****P < 0.0001；NS，不显著。应用意义：从生物标志物到精准治疗蓝图
这项发表于International Journal of Biological Sciences （影响因子11.7）的研究，重新定义了我们对MEN1野生型低级别pNET转移的理解：转移不是“突变更多”的结果，而是“通路状态”的属性 。具体价值体现在三个层面：
风险分层： ZNF273、RYR1、CLCA1等高频突变基因的结构域特异性突变模式，可构成区分转移风险的分子标签，弥补仅凭Ki-67、分级和TMB的不足。机制靶点： 钙信号、WNT、PI3K–AKT三大枢纽被确立为转移相关核心网络，尤其“KRAB-ZNF/钙信号轴”具有治疗可操作性。转化路径： 通过iPathwayGuide与Gene2Drug给出的候选药物短名单（fasudil、spaglumic acid等）及体外/体内验证，为后续生物标志物指导的临床试验提供了直接可测试的蓝图。
对于长期缺乏有效生物标志物和新型系统治疗的pNET患者群体而言，这项工作把“低级别却会转移”的临床谜题，转化为可量化、可干预的分子语言，也为占散发性pNET相当比例的MEN1野生型亚群点亮了精准医学的前路。
本文图片转载自 PMC 开放获取全文，仅供学习参考，请以原文为准。
