原文：Neuronal SPI1 suppression enhances axonal regeneration after spinal cord injury through Rassf10 downregulation.
期刊：Burns & trauma（影响因子 11.0） |
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Graphical Abstract Graphical Abstract: 图文摘要：
脊髓损伤（spinal cord injury, SCI）后，中枢神经系统轴突往往难以自发再生，其中一个关键障碍来自脊髓神经元内在的抑制性特性。长期以来，科研人员一直在寻找能够“松开”这种内在刹车、让受损轴突重新生长的分子开关。近日，一项发表于《Burns & Trauma》（影响因子 11.0）的研究给出了新答案：一个在免疫细胞中大名鼎鼎的转录因子 SPI1（又称 PU.1），在神经元里竟扮演着抑制轴突再生的“反派”角色；而抑制它，则能通过一条全新的 SPI1–Rassf10–p38 MAPK 轴显著促进轴突再生与运动功能恢复。
研究背景：为什么关注神经元里的 SPI1？
SPI1（PU.1）是髓系细胞分化和发育的“主控”转录因子，过去绝大多数研究都集中在小胶质细胞、巨噬细胞等免疫细胞中。然而，近年单细胞测序数据显示，脊髓神经元中也明确表达 SPI1，这提示它可能在神经系统中具有超越免疫调控的“非免疫功能”。
研究团队在前期工作中观察到：在大鼠脊髓发育过程中，神经元内的 SPI1 表达呈现动态变化——胚胎期主要定位于细胞核，出生后逐渐下降并向细胞质转移；而在脊髓损伤后，神经元 SPI1 表达明显上调，并伴随蛋白向核内转位。这一现象让作者提出假设：SPI1 可能是发育过程中轴突生长的负向调控因子，并在损伤后被重新激活以限制再生。
Figure 1 SPI1 在脊髓发育过程中的动态表达。(a) 实验时间线，说明在 E18、出生后第 1 周（P1W）、出生后第 3 周（P3W）和出生后第 8 周（P8W）收集大鼠脊髓组织用于 SPI1 表达分析。取 T8-T11 节段组织进行 qPCR 分析 mRNA、Western blotting 分析蛋白质，以及 IF 观察 SPI1 蛋白定位。(b) E18、P1W、P3W 和 P8W 时 SPI1 表达的 qPCR 分析。数据以平均值±标准差表示，n=3 个生物学重复。采用单因素方差分析（One-way ANOVA）及 Tukey 事后检验进行分析（P<0.05）。图中标出了 P 值。(c) E18、P1W、P3W 和 P8W 脊髓组织中 SPI1 和 NeuN 的免疫组织化学（IHC）染色。左图为代表性 IHC 结果（比例尺：200 μm）；右图为左图白框区域的放大视图（比例尺：50 μm），D，背侧；V，腹侧。(d) (c) 的统计分析。数据以平均值±标准差表示。采用单因素方差分析（One-way ANOVA）及 Bonferroni 事后检验进行分析（P<0.05）。图中显示了 P 值。(e) E18、P1W、P3W 和 P8W 时 SPI1 蛋白表达。左图为代表性 WB 结果，右图为统计分析。数据以平均值±标准差表示，n=3 个生物学重复。采用单因素方差分析（One-way ANOVA）及 Tukey 事后检验进行分析（P<0.05）。图中显示了 P 值
轴突生长对中枢神经系统发育至关重要，也是损伤后神经功能重建的核心。尽管 c-Jun 等转录因子已被证实参与轴突生长调控，但发现新的调控分子，仍可能为神经修复带来全新治疗策略。正是在这一背景下，研究团队系统解析了 SPI1 在脊髓神经元中的功能与机制。
核心发现：SPI1 是轴突再生的“刹车”，抑制它可促进修复
为了验证 SPI1 的功能，作者在原代培养的大鼠脊髓神经元中进行了干预实验。结果显示：敲低 SPI1 能显著促进轴突向外生长，而过表达 SPI1 则明显缩短轴突长度。这说明在神经元中，SPI1 本身就是一个限制轴突延伸的负调控因子。
Figure 2 干预 SPI1 表达在体外显著影响轴突生长。(a) 研究 SPI1 对 E14 脊髓神经元影响的实验设置示意图。(b) 左图：神经元经 siRNA 处理后 SPI1 的 mRNA 表达。右图：神经元经过表达处理后 SPI1 的 mRNA 表达。数据以平均值±标准差表示，n=3 个生物学重复。采用非配对 Student t 检验比较两组（vs siCtrl/pcDNA3.1）。图中显示了 P 值。(c) 神经元经 siRNA 或过表达处理后 SPI1 的蛋白表达。左图：代表性 WB 结果；右图：统计分析。数据以平均值±标准差表示，n=3 个生物学重复。采用非配对 Student t 检验比较两组（vs siCtrl/pcDNA3.1）。图中显示了 P 值。(d) SPI1 siRNA 对轴突生长的影响。左图：用 Tuj1 抗体染色的代表性 IF 图像，比例尺为 50 μm。右图：统计分析。数据以平均值±标准差表示，n=4 个生物学重复，灰点代表 120 个神经元。采用非配对 Student t 检验比较两组（vs siCtrl）。图中显示了 P 值。(e) SPI1 siRNA 对神经元轴突长度比例的影响。左图为神经元经 SPI1 siRNA 处理 48 小时后 Tuj1 的代表性 IF 图像，比例尺为 50 μm。右图：统计分析。(f) PU.1-IN-1（SPI1 特异性抑制剂）对轴突生长的影响。左图为神经元经 PU.1-IN-1（2、10、20 nM）处理 48 小时后 Tuj1 的代表性 IF 图像，比例尺为 50 μm。右图：统计分析。数据以平均值±标准差表示，n=4 个生物学重复，灰点代表 120 个神经元。数据采用单因素方差分析（One-way ANOVA）及 Tukey 事后检验进行分析（P<0.05）。图中显示了 P 值。(g) SPI1 过表达对轴突生长的影响。左图：用 Tuj1 抗体染色的代表性 IF 图像，比例尺为 50 μm。右图：统计分析。数据以平均值±标准差表示，n=4 个生物学重复，灰点代表 120 个神经元。采用非配对 Student t 检验比较两组（vs siCtrl）。图中显示了 P 值。(h) SPI1 过表达对神经元轴突长度比例的影响。左图为神经元经 SPI1 siRNA 处理 48 小时后 Tuj1 的代表性 IF 图像，比例尺为 50 μm。右图：统计分析
更重要的是，这种效应在活体动物中也得到验证。研究利用 CRISPR/Cas9 技术在斑马鱼中突变 spi1 基因，并建立脊髓损伤模型；同时在成年大鼠 T10 半切损伤模型中，通过神经元特异性 AAV9-shRNA 递送系统敲低脊髓神经元中的 SPI1。结果一致表明：抑制 SPI1 后，轴突再生标志物 GAP43、神经丝蛋白 NF200 以及 5-羟色胺（5-HT）能神经纤维的表达均显著增加，动物运动功能也获得更好恢复。
Figure 3 斑马鱼中 spi1 表达突变显著促进脊髓损伤后轴突生长和功能恢复 (a) spi1a 和 spi1b sgRNA 有效性的验证。左图：spi1a PCR 产物的测序峰图；右图：spi1b PCR 产物的测序峰图。(b) 描述操作程序的实验时间线。(c) 利用 CRISPR/Cas9 技术在受精后 30 小时（hpf）spi1 突变对斑马鱼轴突生长的影响。左图：代表性图像（比例尺：50 μm）；右图：统计分析。数据以平均值±标准差表示，每组 n=13 条斑马鱼。采用非配对 Student t 检验比较两组（vs Cas9 蛋白）。图中标出了 P 值。(d) 脊髓损伤后 24 小时 spi1 突变对斑马鱼轴突生长的影响。左图：代表性图像（比例尺：50 μm）；右图：统计分析。数据以平均值±标准差表示，每组 n=11 条斑马鱼。采用非配对 Student t 检验比较两组（vs Cas9 蛋白）。图中标出了 P 值。(e) spi1 敲低后受精后 7 天（dpf）或脊髓损伤后 4 天斑马鱼行为轨迹（红线）的代表性图。(f) 左图：spi1 突变后 7 dpf 未受伤斑马鱼幼鱼 10 分钟内的总移动距离和速度，每组 n=30 条斑马鱼。右图：spi1 突变后受伤斑马鱼（SCI 4 d）幼鱼在 7 dpf 时 10 分钟内的总移动距离和速度，每组 n=20 条斑马鱼。数据以平均值±标准差表示。采用非配对 Student t 检验比较两组（vs ctrl）。图中标出了 P 值。(g) 左图：脊髓损伤后 4 天，Cas9 蛋白对照组和 Cas9 蛋白+spi1a/1b sgRNA 组在 10 秒期间（0、2、4、6、8、10 秒）游泳运动的代表性连续图像。右图：逃逸反应期间最大体尾角（弧度）的量化。数据以平均值±标准差表示。采用非配对 Student t 检验比较两组（vs Cas9 蛋白）。图中标出了 P 值。SCI 脊髓损伤
Figure 4 大鼠神经元中 SPI1 敲低促进脊髓损伤后功能恢复 (a) 脊髓半切及 AAV9-Syn-EGFP-shCtrl 或 shSPI1 病毒注射的实验时间线示意图。在胸段 8（T8）水平进行注射，随后在 T10 进行半切。时间线指示术后样本收集和行为测试。(b) SPI1 敲低效率分析。左图：代表性 Western blot 图像，显示半切后损伤后 7 天和 14 天（dpi）脊髓组织中 SPI1 蛋白水平。右图：以 β-actin 标准化的相对 SPI1 蛋白表达量化。数据以平均值±标准差表示，n=3 个生物学重复。采用非配对 Student t 检验比较两组（vs shCtrl）。图中显示了 P 值。(c) 损伤后不同时间点接受 AAV9-Syn-EGFP-shCtrl 或 shSPI1 治疗大鼠的 BBB 评分。数据以平均值±标准差表示，每组 n=9–12 只大鼠。统计学显著性采用双因素方差分析（two-way ANOVA）及 Bonferroni 事后检验确定（P<0.05）。图中显示了 P 值。(d) 脊髓半切后 7 dpi 的 Catwalk 步态分析。左图：Catwalk 系统捕获的假手术组、shCtrl-7dpi 和 shSPI1-7dpi 组足印代表性序列。右图：步态参数量化，包括最大接触面积（cm2）、平均强度（足压）、支撑基底（外侧足印间距离）和印迹面积（cm2）。数据以平均值±标准差表示，每组 n=8 只大鼠。统计学显著性采用非配对 Student t 检验评估；图中显示了 P 值。(e) 脊髓半切后 14 dpi 的 Catwalk 步态分析。左图：假手术组、shCtrl-14dpi 和 shSPI1-14dpi 组足印代表性序列。右图：关键步态参数总结：最大接触面积、平均强度、支撑基底和印迹面积。数据以平均值±标准差表示，每组 n=6 只大鼠。统计学显著性采用非配对 t 检验评估；图中显示了 P 值。(f) PWL（秒）作为热痛阈值的测量，用于 7 dpi（左图，每组 n=8 只大鼠）和 14 dpi（右图，每组 n=6 只大鼠）接受 shCtrl 和 shSPI1 治疗的大鼠。数据以平均值±标准差表示。采用非配对 Student t 检验比较两组（vs shCtrl）。图中显示了 P 值。(g) 14 dpi 脊髓功能的电生理评估。左图：头端和尾端刺激及 GAS 肌记录的实验设置示意图。中图：假手术-14dpi、shCtrl-14dpi 和 shSPI1-14dpi 组在头端和尾端刺激后从 GAS 肌记录的诱发电位代表性轨迹。右图：头端（左）和尾端（右）刺激后诱发电位幅值的量化。数据以平均值±标准差表示，每组 n=5 只大鼠。统计学显著性采用单因素方差分析评估；图中显示了 P 值
Figure 5 大鼠神经元中 SPI1 敲低促进脊髓损伤后轴突生长 (a) 7 dpi 时 GFAP、GFP、GAP43 和 DAPI 染色的代表性图像。GFAP 表达标记损伤边缘，显示损伤部位 GAP43 阳性和 GFP 阳性细胞的分布。虚线划定损伤区域。图 a1–a4 和 a1′–a4′ 显示方框区域的放大视图。箭头突出 GFP/GAP43 双阳性细胞。R，头端；C，尾端；星号表示损伤侧。比例尺：200 μm（低倍），20 μm（高倍）。(b) 14 dpi 时 GFAP、GFP、GAP43 和 DAPI 染色的代表性图像。GFAP 表达标记损伤边缘，显示损伤部位 GAP43 和 GFP 的分布。虚线划定损伤区域。图 b1–b4 和 b1′–b4′ 显示方框区域的放大视图。箭头突出 GFP/GAP43 双阳性细胞。比例尺：200 μm（低倍），20 μm（高倍）。(c) 7 dpi 时损伤部位相对 GFP 和 GAP43 荧光强度的统计分析。数据以平均值±标准差表示，每组 n=6 只大鼠。采用非配对 Student t 检验比较两组（vs shCtrl）。图中显示了 P 值。(d) 14 dpi 时损伤部位相对 GFP 和 GAP43 荧光强度的统计分析。数据以平均值±标准差表示，每组 n=6 只大鼠。采用非配对 Student t 检验比较两组（vs shCtrl）。图中显示了 P 值。(e) shSPI1 组在 7 dpi 和 14 dpi 时损伤部位 GFP 和 GAP43 的荧光强度线剖面图。(f) 14 dpi 时 GFP、NF200、5-HT 和 DAPI（合并）染色的代表性图像。损伤部位 NF200 阳性纤维和 5-HT 阳性纤维的分布。虚线勾勒损伤区域。图 f1–f4 和 f1′–f4′ 显示方框区域的放大视图。白色箭头突出 GFP/NF200 双阳性纤维，黄色箭头突出 GFP/5-HT 双阳性纤维。R，头端；C，尾端；星号表示损伤侧。比例尺：200 μm（低倍），20 μm（高倍）。(g) 14 dpi 时损伤部位相对 NF200 和 5-HT 荧光强度的统计分析。数据以平均值±标准差表示，每组 n=6 只大鼠。采用非配对 Student t 检验比较两组（vs shCtrl）。图中显示了 P 值
在机制层面，研究通过 RNA-seq 筛选、荧光素酶报告基因实验、ChIP-qPCR 以及 Cut&Tag 等多组学手段，鉴定出 Rassf10 是 SPI1 的直接靶基因。SPI1 能够直接结合到 Rassf10 启动子区域，转录激活其表达；而 Rassf10 的上调会抑制 p38 MAPK 信号通路——具体表现为降低 p-p38（磷酸化 p38）水平，从而阻碍轴突生长。相反，当 SPI1 或 Rassf10 被清除时，p-p38 水平上升，轴突生长增强；而使用 p38 抑制剂则能取消这一促生长效应。
Figure 6 SPI1 通过 Rassf10 调控轴突生长 (a) 维恩图显示三个比较组差异表达基因（DEGs）的重叠：siSPI1 vs siCtrl-DEGs（下调基因，SPI1 敲低 vs 对照）、Cut&Tag-SPI1 vs IgG-DEGs（上调基因，SPI1 染色质结合 vs IgG 对照）和 E18-P1-P3-DEGs（上调基因，发育阶段比较：E18 vs P1 vs P3）。下方条形图量化了每个比较组的独特 DEG 数量。(b) 上图：列出三个比较组中鉴定出的 14 个重叠基因的表格。下图：点图显示 cut&tag-SPI1 vs IgG 比较中上调基因的 GO 富集分析，重点关注神经系统相关生物学过程。(c) 大鼠经 aav9-syn-EGFP-shSPI1 或 shCtrl 处理 21 天后 Rassf10 表达的 qPCR 检测。数据以平均值±标准差表示，n=3 个生物学重复。采用非配对 Student t 检验比较两组（vs shCtrl）。图中显示了 P 值。(d) 左图：神经元经 SPI1 siRNA 处理后 Rassf10 的表达。右图：神经元经 SPI1 过表达处理后 Rassf10 的表达。数据以平均值±标准差表示，n=3 个生物学重复。采用非配对 Student t 检验比较两组（vs siCtrl/pcDNA3.1）。图中显示了 P 值。(e) 神经元中 Rassf10 敲低效率的 qPCR 检测。数据以平均值±标准差表示，n=3 个生物学重复。采用非配对 Student t 检验比较两组（vs siCtrl）。图中显示了 P 值。(f) Rassf10 siRNA 对轴突生长的影响。左图：用 Tuj1 抗体染色的代表性 IF 图像，比例尺为 50 μm。右图：统计分析。数据以平均值±标准差表示，n=4 个生物学重复，灰点代表 120 个神经元。采用非配对 Student t 检验比较两组（vs siCtrl）。图中显示了 P 值。(g) 神经元中 Rassf10 过表达效率的 qPCR 检测。数据以平均值±标准差表示，n=3 个生物学重复。采用非配对 Student t 检验比较两组（vs pcDNA3.1）。图中显示了 P 值。(h) Rassf10 过表达对轴突生长的影响。左图：用 Tuj1 抗体染色的代表性 IF 图像，比例尺为 50 μm。右图：统计分析。数据以平均值±标准差表示，n=4 个生物学重复，灰点代表 120 个神经元。采用非配对 Student t 检验比较两组（vs siCtrl）。图中显示了 P 值。(i) 左图：预测的 Rassf10 基因启动子 −1000 bp 至 +1 bp 内 SPI1 转录因子可能结合位点的示意图。右图：荧光素酶报告基因分析结果。(j) 左图：ChIP-qPCR 分析的代表性结果。右图：Cut&taq-qPCR 分析的代表性结果。抗 IgG/SPI1 抗体免疫沉淀 IgG/SPI1-DNA 复合物；使用 Rassf10 特异性引物通过实时定量 PCR（qPCR）鉴定 IgG/SPI1 结合的 DNA 区域，IgG 用作免疫沉淀对照。数据以平均值±标准差表示，n=3 个生物学重复。采用非配对 Student t 检验比较两组（vs IgG）。(k) siCtrl+pcDNA3.1、siSpi1+siRassf10、siSPI1+3.1-Rassf10 和 3.1-SPI1+siRassf10 处理对轴突生长的影响。左图：用 Tuj1 抗体染色的代表性 IF 图像，比例尺为 50 μm。右图：统计分析。数据以平均值±标准差表示，n=3 个生物学重复，灰点代表 90 个神经元。采用非配对 Student t 检验比较两组（vs siCtrl+pcDNA3.1）。“Ns”表示无显著性
Figure 7 p38 MAPK 信号通路参与 SPI1-Rassf10 轴调控的轴突生长 (a) 神经元经 siSPI1 处理后上调基因的 GO 富集分析中的 GO 条目。(b) 神经元经 siSPI1 处理后上调基因的 KEGG 分析。(c) 神经元经 Spi1/Rassf10 siRNA 处理后 p-Erk1/2 和总 Erk1/2 的蛋白表达。左图：代表性 Western blot 结果；右图：统计分析。数据以平均值±标准差表示，n=3 个生物学重复。采用非配对 Student t 检验比较两组（vs siCtrl）。“Ns”表示无显著差异。(d) 神经元经 Spi1/Rassf10 siRNA 处理后 p-P38 MAPK 和总 P38 MAPK 的蛋白表达。左图：代表性 Western blot 结果；右图：统计分析。数据以平均值±标准差表示，n=3 个生物学重复。采用非配对 Student t 检验比较两组（vs siCtrl）。图中显示了 P 值。(e) SR318（p-P38 MAPK 特异性抑制剂）对 Spi1/Rassf10 siRNA 处理后轴突生长的影响。左图：神经元经 SR318（1、7 和 10 μM）处理 48 小时后 Tuj1 的代表性 IF 图像。比例尺：50 μm。右图：统计分析。数据以平均值±标准差表示，n=3 个生物学重复。灰点代表 90 个神经元。采用非配对 Student t 检验比较两组（vs siCtrl + DMSO）。图中显示了 P 值。(f) 大鼠经 aav9-syn-EGFP-shSPI1/shCtrl 处理 7 dpi 后 p-Erk1/2 和总 Erk1/2 的蛋白表达。左图：代表性 Western blot 结果；右图：统计分析。数据以平均值±标准差表示，n=3 个生物学重复。采用非配对 Student t 检验比较两组（vs shCtrl）。“Ns”表示无显著差异。(g) 大鼠经 aav9-syn-EGFP-shSPI1/shCtrl 处理 7 dpi 后 p-P38 MAPK 和总 P38 MAPK 的蛋白表达。左图：代表性 Western blot 结果；右图：统计分析。数据以平均值±标准差表示，n=3 个生物学重复。采用非配对 Student t 检验比较两组（vs shCtrl）。图中显示了 P 值
综上，研究描绘出一条清晰的信号轴：脊髓损伤后神经元 SPI1 上调 → 转录激活 Rassf10 → 抑制 p38 MAPK 磷酸化 → 限制轴突再生；而靶向抑制 SPI1，则可解除该抑制，促进轴突再生与功能恢复。
Figure 8 SPI1 在脊髓损伤后轴突再生中作用的示意图。脊髓损伤后，SPI1 表达在损伤后 0 至 28 天动态上调。下调 SPI1 表达显著增强大鼠和斑马鱼脊髓损伤后的功能恢复。SPI1 直接调控神经元中 Rassf10 的表达，进而调节 p38 MAPK 信号通路。该图说明了 SPI1 通过 Rassf10 和 p38 MAPK 轴负向调控轴突发生的分子机制，突出了靶向该通路增强神经修复的治疗潜力。（本图的原始图像材料由 GPT image 2 模型和豆包生成，并使用 Adobe Illustrator 2025 进一步编辑。）SCI 脊髓损伤
方法亮点：跨物种、多组学与精准递送的结合
这项研究在方法学上具有多重亮点。首先，它实现了跨物种验证：从体外原代大鼠脊髓神经元、到 CRISPR/Cas9 编辑的斑马鱼幼虫脊髓损伤模型，再到成年大鼠 T10 半切模型并配合神经元特异性 AAV9-Syn-shRNA 立体定位注射，形成了从细胞到整体、从低等到哺乳动物的完整证据链。
其次，在靶基因鉴定上，作者没有依赖单一筛选，而是将三组数据取交集：发育过程中与 SPI1 表达相关的上调基因、Cut&Tag 鉴定的 SPI1 结合基因、以及 SPI1 沉默后下调的基因。这种“三重过滤”策略显著提高了 Rassf10 作为直接靶点的可信度，并通过荧光素酶报告、ChIP-qPCR 和 Cut&Tag 实验逐一验证。
此外，研究还结合了公共单细胞 RNA-seq 数据（GEO 数据库 GSE172167），利用 Seurat 等工具重新分析损伤小鼠脊髓中各细胞类群的 SPI1 表达，确认其在神经元中的存在；同时在行为学评估中采用 BBB 评分、EthoVision XT 自动追踪以及高速摄像分析斑马鱼尾摆幅度，保证了功能评价的客观性与双盲性。
应用意义：为脊髓损伤修复提供新靶点
该研究的发现具有重要转化潜力。传统上，SPI1 被视为免疫细胞主调控因子，而本研究重新定义了它的“双重身份”：既是免疫反应调节者，也是神经元可塑性的抑制因子。SPI1–Rassf10 轴的阐明，为脊髓损伤后神经修复提供了一个全新的治疗靶点。
通过神经元特异性敲低 SPI1，研究在动物模型中实现了轴突再生标志物上升和运动功能改善，且未依赖外源细胞移植或复杂生物材料，仅通过病毒载体介导的基因干预即获得效果。这意味着未来或可开发针对 SPI1 或其下游 Rassf10/p38 通路的小分子药物、反义寡核苷酸或基因疗法，用于促进中枢神经再生。
当然，研究仍停留在临床前阶段。从啮齿类与斑马鱼模型到人类患者，还有递送效率、长期安全性、免疫副作用（因 SPI1 也表达于髓系细胞）等问题需要解决。但毫无疑问，这项工作为理解神经元内在再生障碍提供了新视角，也为“让断掉的神经重新长起来”这一医学难题带来了新的分子线索。
论文信息： 题目 “Neuronal SPI1 suppression enhances axonal regeneration after spinal cord injury through Rassf10 downregulation”，发表于 Burns & Trauma。
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