原文：Cuproptosis-associated genes DLD, ULK2, CCL8, and CCS link metabolic and immunological dysfunction in Parkinson's disease: a multi-omics study. PubMed | PMC 全文（含 PDF）
帕金森病（Parkinson’s disease, PD）是全球第二大神经退行性疾病，仅次于阿尔茨海默病。其典型病理特征是中脑黑质多巴胺能神经元进行性丢失，以及由异常聚集的α-突触核蛋白（α-synuclein）构成的路易小体。临床上，患者不仅表现出运动迟缓、静止性震颤、肌强直和姿势步态障碍等运动症状，还常伴随抑郁、睡眠障碍、慢性疼痛、嗅觉减退和自主神经功能障碍等非运动症状；而这些非运动症状往往在运动症状之前就已出现，却因隐匿而难以早期识别。
尽管PD的确切病因尚未完全阐明，既往研究已提示遗传因素、环境暴露、饮食、衰老和活性氧（ROS）应激之间密切关联。在神经元死亡机制层面，线粒体功能障碍、氧化应激、自噬异常、凋亡、坏死、焦亡、铁死亡以及神经炎症等多种过程都被认为参与PD进展。近年来，一种新定义的铜依赖性细胞死亡方式——铜死亡（cuproptosis） ——进入研究者视野：它依赖于线粒体有氧呼吸，铜离子直接结合并导致三羧酸循环（TCA）中脂酰化蛋白聚集，引发严重的线粒体蛋白毒性应激和代谢崩溃；铁氧还蛋白-1（FDX1）是其关键上游调控因子。由于铜死亡同时牵涉代谢与免疫微环境，研究者推测其可能参与PD的发生发展，并成为潜在治疗靶点。
在此背景下，一项发表于 Frontiers in Immunology （影响因子7.0）的多组学研究，系统分析了铜死亡与PD之间的关系。研究团队通过整合bulk RNA测序、单细胞RNA测序、机器学习、免疫浸润分析、动物模型验证以及药物靶点预测，锁定了四个核心铜死亡相关基因——DLD、ULK2、CCL8 和 CCS ，并揭示它们在PD代谢紊乱与免疫异常中的细胞类型特异性改变。
Figure 1 研究框架。由 Biorender.com 制作。研究背景：从“铜死亡”看帕金森的代谢—免疫交叉
铜死亡不同于凋亡、坏死性凋亡、焦亡或铁死亡等已知程序性死亡方式。其核心机制在于：在线粒体呼吸过程中，过量铜离子与TCA循环中的脂酰化蛋白直接结合，造成这些蛋白异常聚集，进而诱发线粒体蛋白质毒性应激和能量代谢崩溃。FDX1作为上游调控分子，其异常激活会导致铁硫簇蛋白丢失和脂酰化蛋白聚集，从而触发线粒体蛋白脂酰化过程。
由于PD本身即存在显著的线粒体功能障碍和神经炎症，而铜死亡又同时连接“线粒体代谢”和“免疫微环境”两条线索，研究者提出假设：铜死亡不仅可能直接诱导神经元死亡，还可能通过代谢失调和神经炎症参与PD进程。因此，系统描绘PD中铜死亡相关基因的表达图谱，并寻找枢纽基因，对理解PD机制和发现生物标志物具有重要意义。
核心发现：四个枢纽基因浮出水面
研究首先从GEO数据库获取了5套bulk mRNA数据集（GSE28894、GSE26927、GSE20186、GSE42966、GSE49126）和1套单细胞RNA测序数据集（GSE243639）。其中，bulk分析使用了来自85名PD患者和85名匹配对照的脑样本数据（合并GSE28894、GSE26927、GSE20186），并以GSE42966（脑组织）和GSE49126（血液）作为外部验证集；单细胞数据则涵盖15名PD患者和14名对照的黑质样本。
研究者从GeneCards数据库及既往文献中提取了46个铜死亡相关基因（CuAGs）。在合并后的bulk数据集中进行差异表达分析，筛选出差异表达基因（DEGs），再与46个CuAGs取交集，最终获得11个差异表达的铜死亡相关基因（DECuAGs） 。
Figure 2 PD 与对照组之间差异表达基因（DEGs）的分析。(A) 示意图展示了本研究使用的 GEO 数据集及样本量。(B) 整合后 GEO 数据集的后处理。(C) 火山图显示 PD 与对照组之间下调/上调的 DEGs。(D) PD 与对照组之间 DEGs 的热图（前 50）。(E) 使用 Metascape 数据库构建的生物学功能与通路富集网络（前 5）。(F) PD 中富集的代谢通路的 GSEA 分析。Figure 3 PD 与对照组之间差异表达铜死亡相关基因（DECuAGs）的鉴定。(A) 维恩图通过将 DEGs 与 CuAGs 叠加展示 DECuAGs，及其以中等置信度（>0.400）相互作用评分构建的 PPI 网络。(B) 箱线图比较 PD 与对照组之间 DECuAGs 的 mRNA 表达水平。(C) DECuAGs 基因关系网络的环形图。红色条带代表正相关，绿色条带代表负相关。(D) DECuAGs 的相关性热图。数值与色标代表 Pearson 相关系数。(E) DECuAGs 中富集的 KEGG 通路气泡图。气泡大小代表基因数量（Count），颜色对应 P 值。(F) 基因-概念网络揭示 DECuAGs 中富集的 KEGG 条目。节点代表基因（灰色）和生物学通路（按图例着色）。(G) DECuAGs 及其潜在关联基因的 GeneMANIA 相互作用网络。节点（基因）之间的边按相互作用类型着色，节点颜色代表主要生物学功能。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。随后，团队采用三种机器学习算法——LASSO回归、支持向量机递归特征消除（SVM-RFE）和随机森林（RF）——对这11个DECuAGs进行特征筛选。三种算法结果的交集确定了四个枢纽基因：DLD、ULK2、CCL8 和 CCS 。基于测试集的ROC分析显示，这些基因对PD具有诊断价值；研究者还构建了预测PD风险的列线图（nomogram），并通过校准曲线和决策曲线分析评估其性能，同时在外部数据集GSE42966和GSE49126中验证了风险模型。
Figure 4 DECuAGs 相关枢纽基因的筛选及 PD 风险模型的建立。(A) LASSO 回归中选择最优惩罚参数（λ）的交叉验证。误差棒代表每个 λ 处平均偏差的标准误。(B) 具有 LASSO 系数的 DECuAGs 谱。每条曲线代表系数值随 λ 增大相对于 L1 范数的变化轨迹。使用 10 折交叉验证确定 SVM 模型的最优特征数量，显示了预测准确率（C）和预测误差（D）。(E) RF 模型中前 10 个变量重要性排序。(F) 维恩图展示三种机器学习模型筛选出的 4 个交集基因。(G) 测试队列中评估 4 个枢纽基因诊断潜力的 ROC 分析。(H) 测试队列中评估整合预测模型诊断潜力的 ROC 分析。(I) 基于 4 个枢纽基因的 PD 风险预测列线图。(J) 预测模型的校准曲线。(K) 预测模型的临床决策曲线分析。(L) 独立数据集 GSE42966（脑）的 ROC 分析。(M) 独立数据集 GSE49126（血液）的 ROC 分析。功能富集分析表明，这四个枢纽基因与PD中的代谢扰动和免疫景观改变密切相关。共识聚类分析将PD样本分为不同亚群，各亚群在基因表达和免疫浸润细胞组成上存在差异；GSVA进一步揭示了各聚类富集的生物学过程变化。CIBERSORT免疫浸润分析则显示，PD患者与对照之间的免疫细胞比例发生改变，且枢纽基因与浸润免疫细胞之间存在显著相关性。
Figure 5 DECuAGs 相关枢纽基因的综合分析及其一致性聚类分析。(A) 箱线图比较 PD 与对照组之间 4 个枢纽 DECuAGs 的 mRNA 表达水平。(B) 4 个枢纽 DECuAGs 基因组景观的 Circos 图。(C) 4 个枢纽 DECuAGs 的相关性热图。(D) k = 2 时的一致性矩阵热图。(E) k = 2-9 的聚类一致性图。(F) k = 2-9 的一致性累积分布函数曲线。(G) k = 2-9 的 Delta 面积图。(H) 用于验证两个聚类稳健性的主成分分析。(I) 箱线图比较 4 个枢纽 DECuAGs 在两个聚类中的 mRNA 表达水平。(J) 两种分子亚型中 22 种免疫细胞浸润的景观。(K) 箱线图显示每个聚类中 22 种免疫细胞类型的估计比例。(L) 通过 GSVA 评估的两个聚类之间差异 GO 条目活性。(M) 通过 GSVA 评估的两个聚类之间差异 KEGG 通路活性。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。单细胞层面：基因表达具有细胞类型特异性
为了解这些枢纽基因在哪种脑细胞中发挥作用，研究者对GSE243639单细胞数据集进行了Seurat流程分析，包括质控、标准化、高变基因筛选、PCA降维、Harmony去批次、聚类和UMAP可视化，并借助SingleR和CellMarker 2.0鉴定细胞类型。
Figure 6 人黑质公共数据集的单细胞 RNA 序列分析。(A) 整合的单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）数据集的 UMAP 可视化，按样本来源着色。(B) 8 个细胞簇的 UMAP 可视化。(C) 用于细胞类型鉴定的标志基因表达点图。点的颜色和大小分别代表标准化平均表达量和表达细胞的百分比。(D) PD 和对照样本中注释细胞类型的 UMAP 可视化。(E) UMAP 图展示定义 ODC（MOG）、AST（AQP4）、MG（CD74）、OPC（VCAN）、ENT（FLT1）、T 细胞（CD2）和 NEU（SYT1）的典型细胞标志物。NEU 细分为 DaN（TH）和 nDaN（RBFOX1）。(F) PD 与对照组之间细胞类型丰度的比较分析。(G) PD 样本与对照样本的 UMAP 密度图。每个点代表一个单独细胞。分析结果显示，铜死亡相关基因的平均表达（即“铜死亡活性评分”）在PD与对照之间存在差异。四个枢纽基因及关键基因FDX1在不同细胞类型中呈现特异性表达模式：DLD、ULK2、CCL8、CCS分别在特定细胞群中发生改变。进一步的虚拟敲除（scTenifoldKnk）和虚拟过表达（scTenifoldOE）分析提示，这些基因的细胞类型特异性表达可能影响下游基因调控网络及GO/KEGG通路。
Figure 7 PD 与对照组中铜死亡活性及其相关枢纽基因的分析。(A, B) 对照组和 PD 组中按铜死亡相关基因表达投射的单细胞转录组景观。(C) 小提琴图比较 PD 与对照组之间的铜死亡活性。****P < 0.0001。(D) 复合火山图展示星形胶质细胞、小胶质细胞和多巴胺能神经元中 PD 与对照组之间的枢纽 DECuAGs 和 FDX1。(E) 枢纽 DECuAGs：CCS、ULK2、CCL8 和 DLD 的分布与表达谱。细胞间通讯分析（CellChat）发现，PD中尤其是小胶质细胞与星形胶质细胞之间通过NRG信号通路 的推断性细胞间通讯发生改变。这提示铜死亡相关枢纽基因不仅影响细胞内代谢，还可能重塑神经免疫细胞之间的“对话”。
Figure 8 PD 与对照组中的细胞间通讯。(A) 环形图展示 PD 与对照组中 8 个主要细胞群之间相互作用强度的网络。边的厚度表示相互作用的强度，颜色表示源细胞群的身份。(B) 环形图和热图揭示 PD 与对照组中小胶质细胞和星形胶质细胞之间的相互作用强度。颜色梯度反映标准化的相互作用强度。(C) 气泡图突出 PD 与对照组相比小胶质细胞和星形胶质细胞之间的配体-受体相互作用。点大小表示统计学显著性，颜色表示通讯概率。(D) PD 与对照组中 NRG 信号通路的整合可视化。层次图显示 NRG 信号通路的细胞间通讯网络（左）。小提琴图显示相同六个 NRG 通路基因——NRG1、NRG2、NRG3、NRG4、ERBB3 和 ERBB4——在对照组和 PD 组主要细胞类型中的表达分布（中）。弦图显示 NRG 信号通路内配体-受体对水平的细胞通讯（右）。相同颜色表示相同细胞。动物实验验证：小鼠模型中的蛋白水平证据
为了在实验层面支持生物信息学发现，研究者建立了AAV9-A53T α-synuclein PD小鼠模型：将携带突变型A53T-α-synuclein的AAV9载体单侧注射至野生型C57BL/6小鼠右侧黑质，并以AAV9-GFP作为对照。注射12周后，免疫荧光双染显示PD组黑质和尾壳核中酪氨酸羟化酶（TH，多巴胺能神经元标志物）阳性神经元显著减少，同时α-synuclein聚集增加，证明模型建立成功。
Figure 9 A53T α-突触核蛋白小鼠模型的建立。(A) AAV9 注射 12 周后小鼠 SN 和 CPU 的免疫荧光染色，显示 A53T α-突触核蛋白小鼠模型中多巴胺能神经元及其纤维显著减少。绿色荧光（GFP）。粉色荧光（p-αsyn）。红色荧光（TH）。比例尺：1 mm，n = 1。(B) 与对照组相比，A53T α-突触核蛋白小鼠运动表现受损。旷场试验（左图）、转棒试验（中图）和杆试验（右图）的结果。所有数据以均值 ± SD 表示。*P<0.05 vs AAV9-GFP 组（对照组），n = 8。通过多重免疫荧光（mIF）和Western blot，研究者验证了枢纽基因在细胞类型中的蛋白水平变化：在A53T α-synuclein小鼠中，多巴胺能神经元内DLD水平降低 ；小胶质细胞中ULK2和CCL8表达下降 ；星形胶质细胞中CCS含量减少 ；同时这些细胞群中FDX1表达升高。这些结果说明，铜死亡相关枢纽基因的失调与PD中细胞类型特异性的病理改变相关。
Figure 10 A53T α-突触核蛋白小鼠与对照组多巴胺能神经元、小胶质细胞和星形胶质细胞中 DLD、ULK2、CCS、CCL8 和 FDX1 的表达。(A) 代表性 mIF 图像显示 α-突触核蛋白 A53T 小鼠 CPU 中 FDX1 与 TH 的共定位，表明在 PD 病理进展中伴随多巴胺能纤维丢失的铜死亡相关分子活性增加。红色荧光（FDX1）。粉色荧光（TH）。蓝色荧光（DAPI）。比例尺：1.25 mm。(B) 代表性 mIF 图像显示 DLD、FDX1 和 TH 的共定位及其相对荧光强度。(C) 代表性 mIF 图像显示 ULK2、FDX1 和 IBA1 的共定位及其相对荧光强度。(D) 代表性 mIF 图像显示 CCS、FDX1 和 GFAP 的共定位及其相对荧光强度。(E) 代表性 mIF 图像显示 CCL8、FDX1 和 IBA1 的共定位及其相对荧光强度。n = 3。相对荧光强度在归一化至相应标志物阳性细胞数后，从每个样本的三个视野计算得出。绿色荧光（DLD/ULK2/CCS/CCL8）。红色荧光（FDX1）。粉色荧光（TH/IBA1/GFAP）。蓝色荧光（DAPI）。比例尺：低倍镜 50 μm；高倍镜 25 μm。(F) 代表性 Western blot 图像及 DLD、ULK2、CCS、CCL8 和 FDX1 的相对蛋白表达。蛋白水平归一化至 β-actin。每组 n = 5 只小鼠。所有数据以均值 ± SD 表示。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，****P < 0.0001 vs AAV9-GFP 组（对照组）。研究者还进行了药理调控实验：使用铜螯合剂四硫钼酸盐（TTM）和铜离子载体Elesclomol-Cu干预小鼠模型，观察FDX1和TH等蛋白表达变化，以探索调节铜死亡相关分子活性对PD样病理的影响。
Figure 11 AAV9-A53T α-突触核蛋白小鼠模型中铜死亡相关分子活性的药理学调控。(A) 来自 Control + Vehicle、Control + TTM、Control + Elesclomol-Cu、PD + Vehicle、PD + TTM 和 PD + Elesclomol-Cu 小鼠黑质组织中 FDX1 和 TH 的 Western blotting 及其相对蛋白表达定量。FDX1 作为铜死亡相关分子活性的响应标志物评估，TH 用作多巴胺能神经元标志物。(B) 相同处理组黑质组织中 DLD、ULK2、CCS 和 CCL8 的 Western blotting 及其相对蛋白表达定量。蛋白水平归一化至 β-actin 并以相对于 Control + Vehicle 组表示。n = 5。所有数据以均值 ± SD 表示。统计学分析采用双因素 ANOVA 后进行 Šídák 多重比较检验用于预先指定的两两比较。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，****P < 0.0001 vs Control + Vehicle；#P < 0.05，##P < 0.01，###P < 0.001，####P < 0.0001 vs PD + Vehicle；δP < 0.05，δδP < 0.01，δδδP < 0.001，δδδδP < 0.0001 vs PD + TTM。方法亮点：多组学整合与“干湿结合”
这项研究的突出方法学特征在于“多组学+机器学习+实验验证”的闭环设计。首先，在bulk转录组层面，研究者合并多个GEO数据集并去除批次效应，以limma鉴定DEGs；再与46个CuAGs交集得到DECuAGs，并通过STRING构建蛋白互作网络。
其次，在特征选择上，LASSO、SVM-RFE和随机森林三种机器学习算法交叉验证，增强了枢纽基因筛选的稳健性和可重复性；ROC曲线、列线图、校准曲线和DCA则用于评估诊断模型。
第三，单细胞转录组不仅定位了基因表达的细胞来源，还通过scTenifoldKnk/scTenifoldOE进行虚拟扰动，预测基因功能；CellChat则推断细胞间通讯网络，尤其是NRG通路在小胶质细胞—星形胶质细胞轴中的变化。
最后，研究并未停留在计算层面，而是用AAV9-A53T小鼠模型、mIF和Western blot进行实验佐证，并进一步通过DSigDB化合物预测、分子对接和分子动力学模拟，筛选出四种潜在靶向枢纽蛋白的治疗化合物。
Figure 12 靶向枢纽 DECuAGs 的潜在 PD 药物的探索与验证。(A) 筛选的潜在药物分子与药物靶标枢纽 DECuAGs 蛋白之间的分子对接结果及相互作用特征。(B) 分子动力学模拟时间内蛋白-配体复合物的 RMSD。每个蛋白骨架原子相对于其初始结构的 RMSD（单位 Å）对模拟时间（单位 ns）作图。(C) 模拟复合物随时间变化的结合自由能（ΔGbind）。结合自由能（单位 kcal/mol）对模拟时间（单位 ns）作图。在（B, C）图中，蓝色、红色、黄色和绿色曲线分别代表 DLD-5,7-二甲氧基黄酮、ULK2-Crenolanib、CCS-曲古抑菌素（A）和 CCL8-睾酮。应用意义：候选生物标志物与干预靶点
该研究的结论指出，DLD、ULK2、CCL8和CCS这四个铜死亡相关枢纽基因的失调，与PD中的代谢—免疫异常存在潜在关联，而非证明直接的因果或协同调控机制。换言之，它们更像是PD病理网络中的“关联节点”和候选生物标志物。
对科研而言，这项工作把“铜死亡”这一新兴概念引入PD研究，提供了从bulk到单细胞、从计算到动物的完整证据链；尤其是细胞类型特异性表达模式的揭示，有助于未来针对神经元、小胶质细胞或星形胶质细胞分别设计机制研究。
对临床转化而言，四个枢纽基因具备作为PD诊断或分型生物标志物的潜力；而基于药物靶点互作分析预测的四种候选化合物，则为后续针对铜死亡相关蛋白的干预策略提供了起点。当然，正如作者所强调，这些发现仍需进一步实验验证，才能确认其在PD诊疗中的实际价值。
总体而言，这项多组学研究提示：在帕金森病复杂的发病机制中，铜死亡相关基因可能架起了“代谢崩溃”与“神经免疫失调”之间的一座桥梁，而DLD、ULK2、CCL8和CCS，正是这座桥上值得关注的四盏信号灯。
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