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TRIM28稳定RFC4蛋白促进三阴性乳腺癌进展机制获解析

Genelibs文献解读 2026-10-07 01:34 76 次阅读

原文：TRIM28 Increases RFC4 Protein Expression to Promote Triple-Negative Breast Cancer Progression.
期刊：MedComm（影响因子 14.1） | PubMed | PMC 全文（含 PDF）

三阴性乳腺癌（TNBC）是乳腺癌中最为凶险的一种亚型。由于雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和人表皮生长因子受体2（HER2）均为阴性，患者无法从传统的内分泌治疗或抗HER2靶向治疗中获益，临床上面临治疗手段有限、易复发转移和总体预后差等难题。在全球女性癌症相关死亡中，乳腺癌位居前列，而TNBC约占全部乳腺癌的15%–20%，其肿瘤异质性和生物学复杂性使得寻找有效治疗靶点成为迫切需求。

在肿瘤发生发展的分子机制中，DNA复制相关蛋白的异常调控近年来受到关注。复制因子C（RFC）复合物参与DNA复制和DNA聚合酶的协调，由RFC1大亚基和RFC2–RFC5小亚基组成，其中RFC4是组装RFC复合物的核心成分。已有多种生物信息学分析显示，RFC4在多种肿瘤中表达上调，并与不良临床结局相关；但其在TNBC进展和转移中的具体作用仍不清楚。

与此同时，TRIM28（又称TIF1β/KAP1）作为TRIM家族中最大的单蛋白RING型E3泛素连接酶家族成员，既能调控基因转录，也参与DNA损伤应答。它含有N端RING结构域、B-box、卷曲螺旋区及C端PHD和溴结构域，可作为经典E3泛素连接酶发挥作用。然而，TRIM28是否以及如何调控RFC4，此前尚未被阐明。

近期，一项发表于MedComm（影响因子14.1）的研究系统揭示了“TRIM28–RFC4–RAP1–PI3K–AKT”轴在TNBC进展中的关键作用，为TNBC提供了新的潜在治疗靶点。

核心发现：RFC4在TNBC中显著上调并预示不良预后

研究团队首先通过公共数据库和临床样本验证RFC4在TNBC中的表达特征。基于TCGA数据库的分析显示，乳腺癌组织中RFC4表达显著高于正常组织；在GSE38959和CPTAC数据集中也得到一致结果。进一步比较TCGA、CPTAC和METABRIC数据集发现，与其他乳腺癌亚型相比，TNBC中RFC4表达水平明显更高。

**FIGURE 1** FIGURE 1: RFC4在三阴性乳腺癌组织中表达上调并预示较差的总生存期。(A) TCGA中配对的三阴性乳腺癌组织与正常组织中RFC4水平。(B) TCGA中非配对的三阴性乳腺癌组织与正常组织中RFC4水平。(C) GSE38959中三阴性乳腺癌组织与正常组织中RFC4水平。(D–F) TCGA、CPTAC和METABRIC数据库显示，与其他亚型相比，RFC4在三阴性乳腺癌中的表达水平更高。(G) 三阴性乳腺癌中RFC4蛋白表达水平高于正常组织。T：肿瘤，N：正常组织。(H和I) 通过qRT‐PCR检测RFC4的mRNA表达。**p < 0.01。(J) RFC4表达的代表性IHC图像。(a, b) IHC结果显示RFC4在三阴性乳腺癌组织中的表达水平高于癌旁组织。(c, d) RFC4定位于细胞核。(e, f) 淋巴结转移灶中的免疫染色强于原发肿瘤组织。(g, h) 有淋巴结转移的原发肿瘤中RFC4表达水平高于无淋巴结转移者；比例尺，50和100 µm。(K) RFC4高表达与低表达的三阴性乳腺癌患者总生存期的Kaplan–Meier分析。

为验证生物信息学结果，研究者收集了TNBC组织及配对的癌旁正常组织，利用蛋白质印迹（western blot）和RT-qPCR在10对配对样本中确认RFC4在TNBC组织中显著上调。在正常乳腺上皮细胞、TNBC细胞系及非TNBC乳腺癌细胞系中的检测同样表明，RFC4在TNBC细胞中表达升高。

更具临床意义的是，对80例TNBC样本进行的免疫组化（IHC）分析显示，RFC4高表达与肿瘤复发和淋巴结转移显著相关。IHC染色提示RFC4主要定位于细胞核；与癌旁组织相比，TNBC组织中RFC4表达更高；有淋巴结转移的原发肿瘤其RFC4染色强于无转移者。Kaplan–Meier分析进一步表明，RFC4高表达的TNBC患者总生存期更差。

功能验证：RFC4促进TNBC细胞增殖与转移

在明确表达特征后，研究者在TNBC细胞系中开展功能实验。RFC4在MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞中高表达，因此在这两种细胞中稳定敲低RFC4；同时在BT-549和Hs578T细胞中过表达RFC4。

CCK-8和集落形成实验表明，RFC4上调增强TNBC细胞增殖能力，而RFC4缺失则产生相反效果。在裸鼠异种移植模型中，敲低RFC4的MDA-MB-231细胞体内成瘤生长受到抑制。在迁移和转移方面，伤口愈合实验显示RFC4过表达促进细胞迁移，沉默RFC4则抑制迁移；Transwell实验获得一致结果。通过尾静脉注射MDA-MB-231及RFC4敲低细胞构建肺转移模型，结果显示RFC4敲低显著减少肺转移结节数量。

**FIGURE 2** FIGURE 2: RFC4促进三阴性乳腺癌细胞生长和转移。(A和B) 在蛋白质和mRNA水平验证RFC4敲低和过表达慢病毒的转染效率。(C) 使用CCK‐8法评估细胞活力。(D和E) 稳定表达shRFC4或oeRFC4的MDA‐MB‐231和BT549细胞中的集落形成实验。(F) 裸鼠异种移植实验示意图。(G) 注射RFC4敲低或对照MDA‐MB‐231细胞的小鼠体内剥离肿瘤的代表性图像。(H和I) 异种移植肿瘤的生长曲线和最终重量。(J和K) 用于评估细胞迁移的划痕愈合实验。(L和M) 用于评估迁移和侵袭能力的Transwell实验；比例尺，50 µm。(N和O) 用于检测不同实验条件下体内转移潜能的肺转移模型。比例尺，200和2000 µm。(P和Q) 肺重量(P)和转移结节数量(Q)的定量分析。**p < 0.01，***p < 0.001。

机制解析：TRIM28从转录和蛋白稳定性双重层面激活RFC4

为探索RFC4在TNBC中过表达的上游机制，研究者利用UCSC、Human TF、GTRD和PROMO数据库预测可能结合RFC4启动子区的转录因子，筛选出TBP、USF2、POU2F1和TRIM28四个候选分子。TIMER2.0分析显示，在TNBC中TRIM28 mRNA表达与RFC4呈正相关；TCGA和CPTAC数据集也表明TRIM28在乳腺癌尤其TNBC中上调。Western blot和RT-qPCR确认TNBC细胞系中TRIM28蛋白和mRNA水平高于正常乳腺上皮细胞。

功能实验显示，敲低TRIM28降低RFC4蛋白和mRNA水平，过表达TRIM28则升高RFC4；而反向操作RFC4并不影响TRIM28表达，提示TRIM28位于RFC4上游。双荧光素酶报告实验证实TRIM28增强RFC4启动子活性。染色质免疫沉淀（ChIP）实验进一步定位到TRIM28结合在RFC4启动子区的BS2和BS3位点；当这两个位点突变后，TRIM28无法激活RFC4启动子。

**FIGURE 3** FIGURE 3: TRIM28激活RFC4基因转录。(A) 使用UCSC、PROMO、GTRD和human TF数据库预测与RFC4启动子区域结合的蛋白质的Venn图。(B) 使用TIMER 2.0对RFC4与TRIM28进行相关性分析。(C和D) 三阴性乳腺癌细胞中TRIM28表达的免疫印迹分析。(E) 三阴性乳腺癌细胞中TRIM28和RFC4的表达水平。(F和G) TRIM28和RFC4 mRNA表达的qRT‐PCR分析。(H) 评估TRIM28对RFC4启动子活性影响的双荧光素酶报告基因实验。(I) 鉴定TRIM28在RFC4启动子区域内结合位点的ChIP实验。(J) 显示BS2和BS3位点具有转录活性的双荧光素酶报告基因实验。

除了转录激活，研究还发现TRIM28与RFC4蛋白存在直接相互作用。STRING数据库预测两者互作，外源性和内源性Co-IP实验在HEK293T和MDA-MB-231细胞中均验证了TRIM28与RFC4结合。免疫荧光显示二者在核内共定位，细胞组分分离实验也表明它们主要位于细胞核。

通过截短体实验，研究者确定TRIM28的PHD结构域（627–697 aa）与RFC4强结合，而RFC4的AAA结构域（70–220 aa）是互作关键区域。分子对接和点突变实验发现，RFC4的R102和Y182突变后失去与TRIM28的结合能力。

**FIGURE 4** FIGURE 4: TRIM28与RFC4特异性相互作用。(A) 在三阴性乳腺癌和HEK293T细胞中证实TRIM28与RFC4相互作用的Co‐IP分析。(B) 稳定共表达RFC4（绿色）和TRIM28（红色）的MDA‐MB‐231、MDA‐MB‐468和HEK293T细胞中显示TRIM28与RFC4共定位的免疫荧光图像。细胞核用DAPI（蓝色）复染。(C) 三阴性乳腺癌细胞胞质和核组分中TRIM28和RFC4表达的蛋白质印迹分析。(D) 全长TRIM28和RFC4及其截短突变体的示意图。(E) 在三阴性乳腺癌细胞中检测Flag‐RFC4与全长或截短Myc‐TRIM28突变体之间相互作用的Co‐IP分析。(F) 在三阴性乳腺癌细胞中检测Myc‐TRIM28与全长或截短Flag‐RFC4突变体之间相互作用的Co‐IP分析。(G) RFC4与AlphaFold生成的TRIM28同源模型的预测结合模式。RFC4显示为蓝色棒状；氢键以虚线表示，参与结合的关键氨基酸残基显示为黄色棒状。(H) 在HEK293T细胞中Myc‐TRIM28 pull‐down后野生型和突变型Flag‐RFC4蛋白的蛋白质印迹分析。

更关键的是，作为E3泛素连接酶，TRIM28还调控RFC4蛋白稳定性。过表达TRIM28延长RFC4半衰期；蛋白酶体抑制剂MG132而非溶酶体抑制剂CQ能增加RFC4蛋白水平，说明RFC4主要经蛋白酶体途径降解。进一步实验表明，TRIM28以依赖其E3连接酶活性的方式促进RFC4多聚泛素化；使用七种泛素突变体筛选发现，K29R突变显著削弱TRIM28诱导的RFC4泛素化，而“仅保留K29”的泛素质粒实验证实TRIM28主要催化RFC4形成K29连接的多聚泛素链。

位点定位实验将泛素化修饰锁定在RFC4 AAA结构域内的K205和K217；突变这两个位点后，TRIM28诱导的泛素化消失，且K205R、K217R及双突变体蛋白稳定性明显下降。这意味着：TRIM28通过在K205和K217上组装K29连接泛素链，反而增强了RFC4蛋白稳定性，而非促进其降解。

**FIGURE 5** FIGURE 5: TRIM28以K29连接的多聚泛素链泛素化RFC4。(A) 用携带空载体或oeTRIM28的慢病毒转导MDA‐MB‐231细胞，并用放线菌酮（CHX）处理0、4、8和12小时。(B) TRIM28敲低通过蛋白酶体途径促进RFC4蛋白降解。(C) 受TRIM28影响的RFC4上泛素链类型分析。在变性条件下使用抗Flag琼脂糖从转染所示构建体的HEK293T细胞中pull down泛素化蛋白，并用所示抗体进行蛋白质印迹分析。转染24小时后，细胞再用MG132（10 µM）处理4小时。(D) siRNA介导TRIM28敲低后MDA‐MB‐231细胞内源性RFC4泛素化分析。(E) TRIM28介导的RFC4 K29连接多聚泛素化。(F) TRIM28酶活性位点突变对RFC4半衰期的影响。(G) TRIM28酶活性位点突变后RFC4蛋白水平的定量分析。(H) TRIM28在K205和K217位点泛素化RFC4。(I–K) HEK293T细胞中Flag‐RFC4野生型、K205R、K217R和K205/217R突变蛋白半衰期分析。

下游通路：RFC4激活RAP1–PI3K–AKT信号轴

为明确RFC4如何驱动TNBC恶性表型，研究者在RFC4过表达的TNBC细胞中进行RNA-seq，发现412个基因上调、359个基因下调。KEGG和GSEA分析提示RFC4与RAP1信号通路显著相关。RAP1是一种小GTP酶；进一步分析RAP1信号网络后，研究者比较了PI3K–AKT、MAPK和Wnt/β-catenin三条候选通路，发现RFC4对PI3K–AKT通路调控作用最强。

免疫印迹结果显示，RFC4过表达上调RAP1、p-PI3K和p-AKT，激活该通路；而RFC4敲低则抑制之。异种移植瘤的IHC分析也显示，RFC4沉默后RAP1、p-PI3K和p-AKT表达下降。Co-IP实验确认RFC4与RAP1在TNBC细胞中相互作用，且RFC4敲低影响RAP1蛋白半衰期。功能回复实验表明，RFC4以泛素化依赖方式激活RAP1–PI3K–AKT轴，从而增强TNBC细胞增殖和转移能力。

最后，研究者证实TRIM28促癌作用部分依赖RFC4：在MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞中过表达TRIM28的同时敲低RFC4，可部分逆转TRIM28引起的增殖、迁移和侵袭增强。

**FIGURE 6** FIGURE 6: TRIM28部分通过上调RFC4促进三阴性乳腺癌增殖和转移。(A) 慢病毒转导后MDA‐MB‐231和MDA‐MB‐468细胞中TRIM28和RFC4的蛋白质和mRNA水平验证。(B和C) 进行集落形成实验以确定TRIM28敲低和过表达对细胞增殖的影响。(D) 使用CCK‐8法评估细胞活力。(E和F) 使用划痕愈合实验评估细胞迁移能力。(G和H) 进行Transwell实验以评估细胞迁移和侵袭能力；比例尺，50 µm。

**FIGURE 7** FIGURE 7: RFC4通过RAP1‐PI3K‐AKT信号通路促进三阴性乳腺癌。(A) 稳定过表达RFC4的MDA‐MB‐231细胞中RAP1‐PI3K‐AKT通路相关蛋白的免疫印迹分析，并通过siRNA敲低RAP1进一步验证RFC4对PI3K‐AKT通路的影响。(B) 评估RFC4和RAP1对细胞增殖影响的集落形成实验。(C) 评估细胞迁移和侵袭能力的Transwell实验。比例尺：50 µm。(D) 在三阴性乳腺癌细胞中证实RFC4与RAP1相互作用的Co‐IP分析。(E) RFC4敲低后RAP1蛋白半衰期分析。(F) RFC4泛素化状态对RAP1信号通路的影响。(G和H) RFC4泛素化位点突变对细胞迁移和侵袭的影响。比例尺，50 µm。(I) 阐释TRIM28转录激活RFC4、促进其泛素化介导的稳定性并随后激活RAP1‐PI3K‐AKT通路机制的示意图。

方法亮点与数据创新

本研究整合了多组学公共数据库（TCGA、CPTAC、METABRIC、GSE38959、TIMER2.0）与80例临床TNBC样本的IHC验证，从mRNA和蛋白两个层面确立RFC4的临床意义。机制研究上，结合启动子预测、ChIP、双荧光素酶报告、Co-IP、截短体映射、分子对接、泛素突变体筛选及位点突变，完整绘制了“TRIM28结合启动子→转录激活”和“TRIM28催化K29泛素化→稳定蛋白”的双重调控图谱。下游则通过RNA-seq联合KEGG/GSEA锁定RAP1–PI3K–AKT轴，并以体内外功能实验闭环验证。

应用意义：为TNBC提供新的治疗靶点

该研究首次阐明TRIM28–RFC4轴在TNBC中的核心作用：TRIM28既作为转录因子激活RFC4表达，又作为E3泛素连接酶通过非经典K29连接泛素化稳定RFC4蛋白，进而激活RAP1–PI3K–AKT信号促进肿瘤进展与转移。由于TNBC目前缺乏有效靶向手段，这一轴线的发现不仅深化了对TNBC生物学复杂性的理解，也为开发针对TRIM28或RFC4的干预策略提供了理论依据，有望在未来转化为改善TNBC患者预后的新方向。

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