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跨42台流式细胞仪：人类TBMNK检测标准化新框架

Genelibs文献解读 2026-10-14 01:34 41 次阅读

原文：Standardizing a human TBMNK cell assay across instrument platforms: a new framework for producing high-quality, AI-ready reference dataset.
期刊：Frontiers in immunology（影响因子 7.0） | PubMed | PMC 全文（含 PDF）

在再生医学先进疗法（RMAT）飞速发展的今天，细胞与基因治疗正在为许多过去无法治愈的疾病带来根治希望。无论是CAR-T细胞产品，还是造血干细胞移植、免疫细胞治疗，其生产与质控都离不开一项关键技术——流式细胞术（flow cytometry）。它能在单细胞水平上同时测量数十种蛋白标志物，被用来评估细胞产品的“关键质量属性”：活性（viability）、身份（identity）、纯度（purity）、强度（strength）和效力（potency）。

然而，流式细胞术虽然强大，却长期面临一个棘手难题：不同厂家、不同型号、不同实验室的流式细胞仪，甚至同一台仪器在不同时间跑出的结果，往往难以直接比较。仪器光学配置、检测器类型、电压设置、补偿方式、样本处理流程的差异，都会让数据产生偏差。这种“不可比、不可复现”的问题，严重阻碍了科研决策、药物生产放行和临床诊断的一致性。

更关键的是，随着人工智能（AI）与机器学习（ML）进入转化免疫学领域，高质量、标注完善、跨平台可比的公开流式数据集极为稀缺。没有“AI-ready”的参考数据，算法就难以被训练和验证。

为了解决这一系列挑战，美国国家标准与技术研究院（NIST）于2020年发起“流式细胞术标准联盟”（Flow Cytometry Standards Consortium, FCSC），联合产学研多方共同开发标准与测量方案。近日，该联盟工作组WG2在《Frontiers in Immunology》（影响因子7.0）发表了一项大规模跨实验室研究（ILS），首次证明：通过端到端标准化框架，人类T/B/单核细胞/NK细胞（TBMNK）检测可以在多达42台、来自7家厂商的流式细胞仪上实现可比测量，并产出高质量、可溯源至国际单位制（SI）的AI就绪参考数据集。

研究背景：为什么流式标准化如此重要

流式细胞术早已不是陌生技术。过去几十年里，它是监测HIV/AIDS患者CD4+淋巴细胞计数的“金标准”，也是CD34+造血干细胞计数、白血病与淋巴瘤分型、自身免疫病和血液病诊断的核心工具。近年来，随着活细胞药物兴起，它更成为表征先进疗法产品不可或缺的 analytical tool。

2024年，美国FDA在《嵌合抗原受体（CAR）T细胞产品开发考虑指南》中明确承认：流式细胞术是评估细胞活性、身份、纯度和效力的关键分析手段。FDA建议在IND申报中提供详尽的流式检测信息，包括仪器校准、质量控制、SOP、抗体滴定、CAR直接检测以及用于批次放行的全面验证。这意味着，监管层面已经对流式检测的稳健性和可验证性提出了极高要求。

但现实是：尽管业界在仪器校准、标准化和检测协调方面努力多年，由于技术复杂、参考标准缺失，不同仪器、不同站点、不同时间之间的测量置信度和可比性仍不足。公共领域中高质量、完整注释的流式数据稀少，限制了AI/ML方法的发展，也阻碍了流式数据与组学数据整合以支撑精准医学的系统生物学研究。

NIST的FCSC因此设立五个工作组，分别推进：1）仪器校准与标准化；2）细胞检测标准化；3）集中式数据分析；4）基因递送系统的测量保证；5）面向流式应用的AI/ML方法。本文展示的，正是WG2领导的首个ILS成果。

核心发现：42台仪器、21个站点，首次实现跨平台标准化

这项研究以“人类TBMNK细胞检测”为模型——即同时识别T细胞、B细胞、单核细胞和自然杀伤（NK）细胞，并测量细胞活性与健康状态。研究采用10个标志物、8色方案，包含活/死染料与凋亡标志物。

ILS由NIST协调，共有17家联盟成员组织、21个站点参与，动用了42台来自7家制造商的流式细胞仪，涵盖传统流式、光谱流式和成像流式，检测器类型包括光电倍增管（PMT）、硅光电倍增管（SiPM）、雪崩光电二极管（APD）和电荷耦合器件（CCD）。其中Amnis成像流式使用>100 mW高功率激光，而多数常规流式激光功率在30–50 mW。

研究使用统一的研究样本、仪器控制与检测试剂，以及四份标准操作程序（SOP），实现端到端检测标准化。最终目标是：把不同平台的数据放在同一把“尺子”上——细胞计数以“每微升细胞数（cells/µL）”报告，CD标志物表达水平以“等效参考荧光素单位（ERF）”报告，且均可溯源至SI单位。

结果令人振奋：在通过质量控制的32台仪器上，不同流式平台对健康供者PBMC中“活的、非凋亡的”TBMNK各亚群给出了可比的测量结果。也就是说，仪器驱动的可变性被大幅压缩，跨平台、跨站点的可比测量成为现实。

研究还生成了迄今稀缺的高质量参考数据集：42台仪器共提交2382个FCS文件，2266个通过初步QC；最终32台仪器形成完整数据集（1870个FCS文件），经过探测器/参数命名标准化、补偿/解混、转换/缩放、自动门控和校准，成为可供AI/ML使用的“AI-ready”数据集。

**Figure 1** TBMNK 实验室间研究（ILS）的标准化操作方案（SOPs）。工作组 2（WG2）制定了四项 SOP，以确保 TBMNK 细胞计数与健康分析的跨站点协调与标准化：a) SOP-01：使用 Rainbow 8-peak 校准和 8 种不同 FC 微珠进行仪器设置、表征与校准。b) SOP-02：使用 cryoPBMC、lyoPBMC、VersaComp、AbC Total、Pacific Blue 和 Aqua 微珠制备并获取 3 个补偿矩阵。c) SOP-3：研究样本的制备与获取，包括 3 名供体的 cryoPBMC 样本和 TryCytes，并整合绝对计数对照（TruCount）和 FMO 对照。d) SOP-04：数据分析流程，将自动化 FCS 文件处理与导出至标准化报告格式的手动分析结果进行比较。该框架可最大程度降低仪器间变异，并以 SI 可溯源、仪器无关的单位标准化标志物表达水平：细胞计数单位为每 µL 细胞数，CD 标志物表达水平单位为 ERF，从而确保所有参与实验室获得可比较的高质量数据集。cryoPBMC，冻存外周血单个核细胞；FC，荧光补偿；ILS，实验室间研究；lyoPBMC，冻干外周血单个核细胞；SOP，标准操作方案；WG，工作组。

方法亮点：四份SOP搭建标准化骨架

WG2制定了四份SOP，构成整个ILS的操作核心：

SOP-01：仪器设置、表征与校准。使用Rainbow 8峰校准颗粒和8种荧光控制微球（FC beads），固定检测器并进行详细校准。
SOP-02：制备与获取三种补偿矩阵。包括一种基于细胞的补偿（使用冻存PBMC和冻干PBMC），以及两种基于微球的补偿（VersaComp、AbC Total，以及Pacific Blue和Aqua包被微球）。
SOP-03：研究样本制备与获取。使用3名健康供者的冻存PBMC（cryoPBMC）和合成质控细胞TruCytes，整合绝对计数管（TruCount）和FMO对照；统一文件命名。
SOP-04：数据分析流程。比较自动化FCS文件处理与手动分析结果，并导出至标准化报告格式。

在样本层面， thawed PBMC先经Aqua活/死染色、洗涤，再加入TruCount管，配合抗CD45 PerCP-Cy5.5和Annexin V Pacific Blue孵育30分钟；免疫表型管和FMO对照则按SOP加入对应荧光抗体。所有抗体均经过滴定以确保饱和染色。TruCytes作为QC样本，处理流程类似但省略Aqua染色和洗涤步骤。

每台仪器按SOP应产生60个FCS文件：1个Rainbow 8峰、8个FC微球、22个补偿矩阵、9个FMO对照、15个来自3名供者PBMC（每供者2个计数管+3个重复），以及5个单一TruCytes QC样本（2个计数管+3个重复）。

**Figure 2** 手动与集中式数据分析的标准化 QC 工作流程。对 WG2 ILS 中各参与站点生成的 FCS 文件应用了标准化数据质量控制工作流程。该过程包括：(1) 根据 SOP 和样本要求验证是否生成了正确数量的 FCS 文件；对于来自单台仪器的完整数据集，预期为 60 个 FCS 文件。(2) 评估每个 FCS 文件的 QC 标准，包括总事件数大于给定样本类型的既定阈值，且无缺失通道信息。(3) 为每台仪器汇编通过 QC 的 FCS 文件列表，并确定具有满足所有 QC 标准的完整 FCS 文件集的样本处理-仪器数量。文件质量检查后，共 32 个样本处理-仪器数据集（1,870 个 FCS 文件）随后经过检测器/参数命名标准化、补偿/解混、转换/缩放、自动化设门和校准处理。经校准或补偿/解混的数据集计划作为 AI 就绪数据集另行撰文发表。将 CDA 的自动化设门结果与研究对象按 SOP-04 提供的手动分析结果进行比较。汇总结果展示于托管在专用项目网站上的交互式可视化仪表板中。FC，荧光补偿；QC，质量控制；SOP，标准操作方案。

数据质量控制极为严格。三道筛选标准：第一，文件必须完整（15个PBMC文件、9个微球文件、1套完整补偿矩阵8个文件）；第二，事件数达标——微球相关文件≥8000，补偿矩阵≥3000，PBMC相关文件≥20000；第三，PBMC的FCS文件必须包含时间通道、FSC-A/SSC-A、FSC-H/SSC-H以及全部8个荧光通道。只有全部通过的文件才进入集中式数据分析（CDA）。

QC过程用Python 3.12和Snakemake流水线（结合Python 3.12.6与R 4.4.3）双正交方法执行，结果通过Gradio包汇总，并部署在交互式可视化仪表板：https://miganalytics.nist.gov/content/4269cf8d-b270-44ae-a4e4-b1f8d7d9ee96/ 。联盟成员和更广泛社区可借此探索ILS结果、进行比较分析。

**Figure 3** 遵循不同 SOP 的样本与仪器间 QC 结果的仪表板可视化。数据集以符号阵列可视化，42 列代表样本处理仪器，60 行代表 SOP 规定的实验。每个符号对应单个 FCS 文件的 QC 状态。蓝色圆圈表示通过质量控制（QC）的文件，橙色六边形表示缺失的 FCS 文件。多色六边形表示特定的 QC 失败模式，包括缺失散射或荧光通道（FSC-A/SSC-A、FSC-H/SSC-H 或荧光）、缺失时间通道、事件数不足和电压反转。若某仪器在 SOP-1 区块和 SOP-3：Test Pheno 区块内的所有实验均通过 QC，则视为该仪器通过 QC。基于此标准，42 台站点仪器中有 32 台通过 QC 并被纳入下游分析。红色阴影列背景表示未通过此基于 SOP 的 QC 标准的仪器（即 SOP-1 或 SOP-3：Test Pheno 中至少一项必需实验未通过 QC）。

结果细节：从百分比、绝对计数到ERF单位

研究比较了站点手动分析与CDA自动分析对PBMC和TruCytes样本中各细胞亚群频率与绝对计数的结果。图4展示了淋巴细胞亚群（B细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、NK细胞及总T细胞等）的百分比与绝对细胞数。

**Figure 4** PBMC 和 TruCytes 样本中细胞亚群频率与绝对细胞计数的比较。(A) 在 PBMC 样本（橙色）和 TruCytes 样本（蓝色）中测得的淋巴细胞亚群（B 细胞、CD4+ T 细胞、CD8+ T 细胞、NK 细胞和总 T 细胞；上图）和主要白细胞群（淋巴细胞和单核细胞；下图）的百分比。每个点代表单台仪器的结果。(B) 使用 TruCount 微珠作为内部计数标准测得的 CD45+ 单个核细胞及其亚群的绝对计数。图中显示了 PBMC 供体 1（橙色）和 TruCytes 样本（蓝色）在各仪器上的结果。(C) 在 3 名健康供体的 PBMC 样本中，于 3 个补偿矩阵下跨仪器测得的 CD3+ T 细胞百分比。补偿矩阵 1 基于细胞，而矩阵 2 和 3 基于微珠，使用来自两个不同供应商的两种微珠试剂盒。颜色表示供体，符号表示 3 个独立补偿矩阵。点代表三次重复测量。

在标志物表达方面，研究计算了7个CD标志物在32台仪器上的平均ERF值。ERF值具有激发波长依赖性，并可溯源至8种NIST参考荧光素溶液及其不确定度；它建立了一个绝对的、与发射滤光片无关的荧光尺度。相比之下，另一种ARI值则依赖特定发射滤光片，用于表征某台仪器自身的荧光特性。ERF尺度让不同流式平台的数据得以放在同一标准单位下比较。

**Figure 5** 32 台流式细胞仪上 7 种 CD 标志物在等效参考荧光团数（ERF）单位中的平均表达水平。图中展示了 7 种 CD 标志物的平均表达值：CD3 FITC、CD14 APC、CD8 APC-Cy7、CD15/CD56 PE、CD4 PE-Cy7、CD45 PerCPCy5.5、CD19 APC，以 ERF 单位报告，并在 32 台流式细胞仪上取平均值。对于每种 CD 标志物，首先对每台仪器每名供体的样本三次重复的 ERF 值取平均。然后计算各参与仪器平台的最终平均 ERF 值和 % CV。

图6直观显示了ERF标准化的威力：以供者#2的CD19 APC信号为例，在不同流式平台上，标准化前信号值因平台而异；经过ERF标准化后，表达水平被拉到可比的尺度上，平台依赖性变异被显著削弱。

**Figure 6** ERF 标准化前后 CD19 APC 信号的仪器平台依赖性变异。在通过质量控制（QC）和离群值检查的不同流式细胞仪平台上测得的供体 #2 的 CD19 APC 表达水平。数据以中值荧光强度（MdFI；上图）和 ERF 单位（下图）表示。每根柱代表从单个仪器型号获得的中值信号，说明了原始荧光强度的仪器平台依赖性变异以及 ERF 标准化后可比较性的改善。

对于CD3+ T细胞百分比测量，研究用ANOVA将变异拆解为四个来源：样本处理+仪器+手动分析合并项、补偿对照、样本重复和残差。图7展示了三个供者PBMC样本合并后的方差贡献，说明即使存在多环节变异，标准化框架仍能定位并压缩主要不确定性来源。

**Figure 7** CD3+ T 细胞群测量中的变异来源。(A) 通过 ANOVA 确定并汇总自 3 名供体 PBMC 样本的 CD3+ T 细胞百分比的方差贡献。方差被划分为样本处理-仪器-手动分析、补偿对照、测量重复和残差分量。(B) 从站点报告的手动分析和集中式数据分析（CDA）获得的 CD3+ T 细胞百分比的变异系数（CV）。每个点代表一个供体-补偿矩阵组合，线条连接配对测量值。

统计分析使用Python的numpy 1.26.4和statsmodels 0.14.6包，仅纳入通过QC的32台仪器结果。对每个CD标志物，先对每台仪器每供者的三次重复取平均ERF，再跨仪器比较，离散程度用变异系数（CV）表示。离群值定义为偏离均值超过1.96个标准差（|z|>1.96）的仪器值；研究选择报告而非删除离群值，并明确说明其对CV的影响。

应用意义：为AI、监管与临床架起桥梁

这项工作的价值远不止于“把42台仪器调成一致”。首先，它产出的高质量、AI-ready参考数据集，为转化免疫学中AI/ML技术的验证提供了关键基础。公共领域长期缺乏完整注释的跨平台流式数据，而该数据集附带严格QC、标准化命名、补偿/校准流程和可视化仪表板，可直接用于训练与测试自动门控、群体识别算法。

其次，对监管科学和先进疗法制造而言，SI可溯源单位（cells/µL与ERF）意味着不同企业、不同合同检测实验室、不同临床中心的数据可以放在同一框架下比对。这对CAR-T等产品的批次放行、多中心临床试验和上市后监测至关重要。

再次，研究也指出下一步方向：整合自动化样本制备是进一步降低检测不确定度、增强跨平台可重复性的必要步骤。人工操作仍是变异来源之一，自动化将把标准化从“仪器端”延伸到“样本端”。

总体而言，NIST FCSC的这项ILS首次证明：通过统一SOP、参考材料、SI可溯源单位和集中式数据分析，流式细胞术完全可以在多样化仪器平台上实现端到端标准化。这不仅为TBMNK检测树立了新框架，也为整个流式领域迈向“可量化、可比较、可AI化”的未来打下了基石。

本文图片转载自 PMC 开放获取全文，仅供学习参考，请以原文为准。

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